開口箭甲醇提取物抗氧化和抑菌活性研究

石宛平，張怡軒，林奇泗，2，王淼，王慧，趙春杰，*

（1.沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽 110016；2.徐州醫學院藥學院，江蘇 徐州 221004）

中藥開口箭別名牛尾七、巖七，為百合科鈴蘭族開口箭屬植物開口箭Tupistra chinensis Bak.，以根狀莖入藥[1]。夏秋二季采挖，除去須根，洗凈，曬干。主要分布于湖北、江西、福建、安徽、河南、陜西、四川、云南、廣西，生于林下陰濕處，溪邊和路旁，海拔1 000 m～2 000 m[2]。其味甘，微苦。有毒。具有清熱解毒，散瘀止痛。用于白喉，風濕關節痛，腰腿疼，跌打損傷，毒蛇咬傷；外用治癰癤腫毒[3]。

開口箭的醇提物對咽喉部常見致病菌如金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌等有較好的體外抑菌作用[4]。本文采用圓盤擴散法比較了開口箭醇提取物的對2 種細菌和2 種真菌的抑制活性。至2013 年1 月1日為止，鮮見對開口箭提取物的抗氧化活性研究報道。抗氧化活性的機制較為復雜，應采用一種以上方法對藥物的抗氧化研究[5]。本文對開口箭醇提取物進行抗氧化活性的研究，并比較開口箭醇提取物中石油醚層、氯仿層、乙酸乙酯層和正丁醇層的抗氧化活性，為進一步探討開口箭藥理作用打下基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設備

HH-2 數顯恒溫水浴鍋：浙江省嘉興市俊思儀器設備廠；HH-3 數顯恒溫油浴鍋：江蘇金壇市江南儀器廠；SC-97 自動三重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；BS110 電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；UV-1700 型可見-紫外分光光度計：日本SHIMADZU公司。

1.2 實驗材料

1.2.1 材料與試劑

無水硫酸鈉（分析純）：天津大茂化學試劑廠；實驗用水為實驗室自制三重蒸餾水；甲醇、乙醇（95%）、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和二甲基亞砜：均為分析純，山東禹王實業有限公司；2，4，6-反式2-吡啶基三嗪（TPTZ）、維生素C（VC）：上海阿拉丁試劑有限公司；開口箭藥材：鵬翔藥業，批號90021，經沈陽藥科大學中藥學院賈景明教授鑒定，為百合科開口箭屬植物開口箭Tupistra chinensis Bak.的根狀莖，將開口箭藥材粉碎，過二目篩，貯于干燥器中備用。

1.2.2 供試菌種

大腸埃希氏菌（ATCC8739）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、白色念珠菌（ATCC26970）和新型隱球菌（ATCC9763）：由沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院提供。細菌菌株在37 ℃下Luria-Bertani（LB）培養瓊脂中培養24 h，真菌在30 ℃下馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）中培養72 h。

2 方法

2.1 開口箭提取物制備

2.1.1 開口箭甲醇提取物制備

取開口箭粉末約10 g，加入甲醇150 mL 索氏提取6 h。提取液濾過后用旋轉蒸發儀（溫度50 ℃）濃縮干燥，得深棕色浸膏備用。

2.1.2 開口箭不同萃取溶液制備

取根據2.1.1 制得的開口箭浸膏，加入100 mL 蒸餾水溶解，分別依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取3 次。合并石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取液，并濃縮至干，放至冰箱冷藏備用。

2.1.3 TPTZ 工作液的配制

將2.5 mL 20 mmol/L FeCl3·6H2O，2.5 mL 10 mmol/L TPTZ（以40 mmol/L 鹽酸溶解），25 mL 0.3 mmol/L 的醋酸緩沖液（pH3.6），臨用前混合。

2.2 開口箭抑菌活性研究

2.2.1 抑菌活性研究

通過圓盤擴散法[6]進行開口箭抑菌活性研究，將由2.1 制得的開口箭的醇提浸膏溶解在2%的二甲基亞砜中制成最終濃度為40 mg/mL 的溶液，通過0.2 μm的微孔濾膜過濾，滅菌備用。將含有細菌108 CFU/mL和真菌106 spore/mL～107 spore/mL 的滅菌生理鹽水300 μL 分別均勻涂在Luria-Bertan（iLB）培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）上。將30 μL 的開口箭醇提取液和2%的DMSO（作為陰性對照）浸漬在直徑6 mm 的濾紙片上，將浸漬好的濾紙片放在被接種的瓊脂上。接種細菌菌株的培養皿在37 ℃下培養24 h，接種真菌菌株的培養皿在30 ℃下培養72 h。用抑制區的直徑來衡量抗菌活性的大小。每個試驗重復兩次。

2.2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定[7]

將開口箭的醇提取物溶解在2%的DMSO 中，用二倍稀釋法稀釋并添加到各種供試菌的菌懸液。對于真菌實驗，培養皿在30 ℃培養72 h；對于細菌實驗，培養皿在37 ℃培養24 h。以沒有肉眼可見的細菌或真菌生長時的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 對DPPH 自由基的清除作用[8]

將由2.1.1 制得的開口箭醇提物及由2.1.2 制得的4 種溶劑萃取物用95 %乙醇溶解并配制為一系列不同濃度受試樣品乙醇液。分別取2.0mL 待測液與2.0mL 0.2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液混合，振搖均勻后放于暗處靜置30 min，于518 nm 處測定吸光度（A）i。同時測定2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液與2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度（A）j，以及2.0 mL 待測液與2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度（AC），加樣情況見表1。

表1 DPPH 試驗反應液試劑組成與體積Table 1 Compositions and volumes of DPPH assay

按式（1）計算清除率，每樣測定3 次并取平均值。以維生素C 水溶液的標準溶液為陽性對照。再根據不同濃度樣品的清除率作曲線求出半清除率（EC50）。

2.3.2 FRAP 法測定總抗氧化能力[9]

FeSO4標準曲線的制作：分別取不同質量濃度的FeSO4溶液50 μL，各加入3.0 mL 2.1.3 項下配制的TPTZ 工作液，37 ℃水浴30 min，測定597 nm 處的吸光度。以吸光度為縱坐標，FeSO4質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

樣品總抗氧化能力的測定：準確吸取樣品溶液50 μL，加入3.0 mL TPTZ 工作液，37 ℃水浴30 min，測定597 nm 處的吸光度。

3 結果與討論

3.1 開口箭甲醇提取物對4 種病原菌的抑菌活性

開口箭甲醇提取物對四種病原菌的抑菌圈大小及最小抑菌濃度見表2。

表2 開口箭甲醇提取物的抗菌活性Table 2 Antimicrobial activity of the methanol extracts from Tupistra chinensis

由表2 可知，開口箭甲醇提取物對細菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）的抑制效果明顯，尤其對金黃色葡萄球菌的抑制作用最好，但對真菌（白色念珠菌和新型隱球菌）的抑制作用不明顯。

3.2 開口箭提取物抗氧化活性測定

3.2.1 對DPPH 自由基的清除作用

不同極性溶劑萃取開口箭萃取得率存在較大的區別，結果見表3。

表3 四種溶劑萃取結果Table 3 Yields of four fractions of Tupistra chinensis

分別測出開口箭一系列不同濃度甲醇提取物吸光度Ai，Aj，AC，根據公式（1）計算出其相應的自由基清除率。本研究以維生素C（VC）為對照，測定開口箭甲醇提取物的濃度-清除率曲線，濃度以mg（生藥量）/mL計算，結果見圖1。

圖1 開口箭甲醇提取物DPPH 清除率測定結果Fig.1 DPPH radical scavenging activities of the methanol extract from Tupistra chinensis

從圖1 可看出，自由基清除率隨著加入量的增加而增加，但隨著抗氧劑濃度的增加，其捕獲的DPPH 自由基也越多，逐漸達到飽和狀態，變化也逐漸趨于緩慢。開口箭甲醇提取物的抗氧化活性略強于維生素C。

半清除率指清除率為50%時所需樣品的濃度，所需濃度越低，表明半清除率越高。根據不同濃度樣品的清除率作曲線求出半清除率（EC50），濃度以mg 生藥量/mL 計算。本實驗比較了開口箭石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的半清除率（EC50），結果見圖2。

圖2 開口箭四種萃取物半清除率比較Fig.2 EC50s of the 4 fractions of Tupistra chinensis

由圖2 可知，開口箭醇提取物對DPPH 自由基有良好的清除作用。開口箭醇提取物各層對DPPH 自由基的清除能力次序為：開口箭石油醚層<開口箭乙酸乙酯層<開口箭氯仿層<開口箭正丁醇層。

3.2.2 FRAP 法測定總抗氧化能力

實驗確定了以FeSO4為對照品的總還原能力標準曲線方程y=0.195x+0.003（r=0.999 2）。由此得出開口箭甲醇提取物的FRAP 值為（0.196±0.007）mmol/g。而開口箭石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物的FRAP 平均值分別為1.85×10-3、1.38×10-2、1.30×10-2和1.46×10-2mmol/g，結果見圖3。

圖3 開口箭四種萃取物FRAP 值Fig.3 FRAP value of the 4 fractions of Tupistra chinensis

開口箭醇提取物各層的抗氧化能力次序為：開口箭石油醚層<開口箭乙酸乙酯層<開口箭氯仿層<開口箭正丁醇層。與對DPPH 自由基的清除能力一致。

4 結論

本研究表明開口箭甲醇提取物具有一定的抑菌活性。開口箭甲醇提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌這兩種細菌的抑制效果明顯，但對白色念珠菌和新型隱球菌這兩種真菌的抑制作用不明顯。開口箭不同溶劑萃取物的抗氧化活性，在一定的濃度范圍內都呈現出一定的量效關系，即提取物的濃度越大，抗氧化活性越高。其中石油醚萃取物的抗氧化活性最弱，而氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取物的抗氧化活性較強。開口箭是一種具有廣闊開發前景的中藥材。據文獻報道，開口箭還具有抗炎[10]及抗腫瘤[11]的作用，對開口箭的藥品開發和綜合利用還有待于進一步研究。

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