紅曲霉固態發酵生產MonacolinK的工藝優化

殷軍帥，梁秋麗，方佳茂，羅石柱，孫中濤，*

（1.山東農業大學生命科學學院，山東 泰安 271018；2.廣東環西生物工程有限公司，廣東 普寧 515300）

Monacolin K 又 稱Lovastatin、mevinolin 和Mevacor，是一種抑制膽固醇合成的藥物，最初由日本學者遠滕章（Akira Endo）于1979 年從紅曲霉（Monascus ruber）的次級代謝產物中發現[1]，隨后陸續從土曲霉（Aspergillus terreus）、青霉屬（Penicillium）和木霉屬（Trichoderma） 等真菌的次級代謝產物中發現[2]。Monacolin K 可通過競爭性抑制膽固醇合成限制酶—3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMG-CoA）的活性而抑制膽固醇的合成，從而降低人類和動物的血漿膽固醇水平[3-4]。此外，Monacolin K 還具有抑制腫瘤，預防和治療動脈硬化、冠心病、高血壓、肥胖癥等作用[5-8]。

目前，Monacolin K 主要是以紅曲霉通過固態發酵或液態發酵的方式進行生產。歐美等西方國家推崇液態發酵，主要是因為其自動化程度高、勞動強度低、生產效率高；但液態發酵設備投資大、能耗高、發酵液產物濃度低，提取困難、生產成本高。固態發酵具有液態發酵不可比擬的優勢，主要是設備投資小、能耗低、生產過程節水、生產成本低、無廢水廢渣產生、不會造成二次污染，并且固態發酵的產物可以全部被利用，從而省去了復雜的提取過程，可進一步降低生產成本[9-10]。因此，固態發酵是國內Monacolin K 最主要的生產方式。

Plackett-Burman 實驗設計與響應面法（response surface methodology，RSM）已廣泛地應用于發酵工藝優化，其中包括Moancolin K 的液態發酵工藝[11-12]，但少有用于Moancolin K 固態發酵工藝優化的報道[13]。本篇論文采用Plackett-Burman 與Box-Benhnken 實驗設計對紅曲霉固態發酵生產Monacolin K 的工藝進行了系統的優化，以提高Monacolin K 的產量，降低生產成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

紅色紅曲霉（Monascus ruber MY-01）：由山東農業大學生命科學學院發酵工程研究室分離保存。

1.1.2 培養基

菌種保藏培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）；種子培養基（g/L）：葡萄糖30、蛋白胨20、硝酸鈉2、磷酸二氫鉀1、硫酸鎂1、pH 自然；固體發酵基礎培養基：市售粳米50 g，放于250 mL 的三角瓶中，加水浸泡2 h，于0.08 MPa 滅菌20 min[14]。

1.1.3 主要儀器和試劑

LC-310 液相色譜儀：江蘇天瑞儀器股份有限公司；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋：龍口市先科儀器公司；DHZ-D 大容量全溫振蕩器：太倉市實驗設備廠；HJ-CF-2D 型雙人凈化工作臺：上海蘇凈實業有限公司；Monacolin K 標準樣：浙江海正藥業；甲醇、乙腈為國產色譜純；葡萄糖、麥芽糖、甘油、蔗糖、蛋白胨、無水乙醇、無機鹽等試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

斜面培養：挑取1 環新鮮菌種接種于菌種保藏培養基，30 ℃恒溫培養7 d。三角瓶種子培養：將斜面菌種用5 mL 無菌水洗下孢子，吸取1 mL 接種于裝有200 mL 種子培養基的500 mL 三角瓶中，30 ℃、150 r/min恒溫培養48 h。固態發酵：將三角瓶種子液接種于裝有50 g 發酵培養基的250 mL 三角瓶中，于30 ℃的恒溫培養12 d。

1.2.2 Monacolin K 的檢測[2]

準確稱取MonacolinK 標準樣品0.0200 g，于100 mL的容量瓶中用甲醇定容，配成濃度為0.2 mg/mL 的標準溶液。

固態發酵樣品于40 ℃烘干至恒重，研磨成粉末，取2 g 粉末樣品加入裝有100 mL 甲醇∶蒸餾水（1∶1，體積比）萃取液的250 mL 三角瓶中，于30 ℃，200 r/min萃取2 h，然后10 000 r/min 離心10 min，取上清液用0.45 μm 微膜過濾，收集濾液待測。Monacolin K 檢測采用高效液相色譜法，色譜柱為C18柱，流動相為0.02 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.7）∶乙腈=65∶35（體積比）；紫外檢測器的波長為238nm，體積流量為1mL/min。

1.2.3 干重減重

固態培養時，直接測量絲狀真菌的生物量十分困難，這是因為很難從固體基質中將菌絲體分離出來。Terebiznik and Pilosof[15]發現菌絲體的生長量與基質的干重減重呈正相關，因此可以通過測定基質的干重減重來間接反映真菌在固態發酵體系中的生長狀況。

1.2.4 最佳附加碳源與氮源的選擇

在基礎培養基的基礎上，分別加入2%（質量分數）的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油、麥芽糖、乳糖，按上述方法進行固態發酵實驗，以確定最佳附加碳源的種類，然后再通過0%、2%、4%、6 %、8 %、10 %、12%（質量分數）等7 個水平的單因素試驗確定其最佳用量。

在最佳附加碳源優化結果的基礎上，分別加入1 %（質量分數）的蛋白胨、酵母浸粉、硝酸銨、氯化銨、硝酸鈉，按上述方法進行固態發酵實驗，以確定最佳附加氮源的種類，然后再通過0 %、1 %、2 %、3 %、4 %、5%（質量分數）等6 個水平的單因素試驗確定其最佳用量。

1.2.5 Plackett-Burman 試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用7 因素的Plackett-Burman 試驗設計，考察培養基含水量、裝瓶量、接種量、pH、溫度、附加碳源和氮源等因素對Monacolin K產量的影響，以確定其顯著因素。各因素及其水平見表1。試驗設計和數據分析均采用軟件Design Expert 7.1（Stat-Ease Corp.，Minneapolis，MN，USA）。

表1 Plackett-Burman 試驗的因素和水平Table 1 The coded and uncoded values of factors in Plackett-Burman design

1.2.6 Box-Behnken 試驗設計

在Plackett-Burman 實驗的基礎上，采用Box-Behnken 中心組合設計對影響Monacolin K 產量的3個顯著性因素作進一步的優化，實驗因素與水平見表2。采用最小二乘法對實驗數據進行擬合得二元多項方程為：

式中：Y 為Monacolin K/（mg/g）；xi，xj為自變量代碼值；βo為常系數；βi為線性系數；βii為二次項系數；βij為交互項系數。實驗設計和數據分析均采用軟件Design Expert 7.1 （Stat-Ease Corp.，Minneapolis，MN，USA）。

表2 Box-Behnken 試驗的因素和水平Table 2 Experimental ranges and levels of the independent variables in Box-Behnken design

1.2.7 發酵時間對基質干重減重和Monacolin K 產量的影響

取數個三角瓶，按照所優化后的條件進行發酵。從第1 天開始，每隔1 天取1 次樣，每次做3 個平行。按上述方法檢測并分析數據，以探討發酵時間對基質干重減重和Monacolin K 產量的影響。

2 結果與分析

2.1 附加碳源對Monacolin K 產量的影響

本實驗向基礎培養基中添加的數種附加碳源對Monacolin K 產量的影響見圖1 所示。

圖1 附加碳源對Monacolin K 產量的影響Fig.1 Effect of extra carbon sources on the production of Monacolin K

由圖1 可知，附加碳源葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、乳糖等碳源均可顯著提高發酵水平（P＜0.01），其中以添加葡萄糖、蔗糖和麥芽糖時Monacolin K 的產量最高，三者之間差異不顯著（P＞0.01）。綜合考慮生產成本，我們選用價格較低的葡萄糖為最適附加碳源。此結果與魏培蓮等[16]的研究結果一致，但在熊曉輝等[17]的研究中甘油是最佳碳源，這可能因為所采用的紅曲霉菌株不同，其生理特性存在差異。另外，通過實驗可知附加碳源葡萄糖的添加量對紅曲霉生長量和Monacolin K 的產量有很大的影響，見圖2。

圖2 葡萄糖含量對Monacolin K 產量與干重減重的影響Fig.2 Effect of glucose on the production of Monacolin K and dry matter weight loss

由圖2 可知，當葡萄糖的含量為2%（質量分數）時，基質的干重減重最大，紅曲霉菌絲體生長最好，此時的Monacolin K 的產量最高，為12.62 mg/g。

2.2 附加氮源對Monacolin K 產量的影響

本實驗向基礎培養基中添加的數種附加氮源對Monacolin K 產量的影響見圖3 所示。

圖3 附加氮源對Monacolin K 產量的影響Fig.3 Effect of extra nitrogen sources on the production of Monacolin K

由圖3 可知，蛋白胨作為附加氮源時，Monacolin K的產量遠高于酵母浸粉、硝酸銨、氯化銨和硝酸鈉等作為附加氮源時Monacolin K 的產量，其差異達到了顯著水平（P＜0.01）。此結果與董永勝等[18]的研究結果一致，但在熊曉輝等[17]的研究中，玉米漿是最佳氮源，這表明不同的生產菌株，其最適氮源也存在差異。蛋白胨含量對Monacolin K 產量與干重減重的影響見圖4。

圖4 蛋白胨含量對Monacolin K 產量與干重減重的影響Fig.4 Effect of peptone on the production of Monacolin K and dry matter weight loss

由圖4 可知，蛋白胨的添加量對紅曲霉生長量和Monacolin K 的產量有很大的影響，其中當蛋白胨的含量為1%（質量分數）時，紅曲霉菌絲體生長的最好，基質的干重減重最大，此時Monacolin K 的產量最高，為12.34 mg/g。

2.3 Plackett-Burman 試驗結果

Plackett-Burman 試驗結果如表3 所示，采用Design Expert 7.1 軟件對試驗數據進行一次多項回歸擬合，獲得一次回歸方程：

式中：Y 為Monacolin K，（mg/g）；X1～X7為自變量的編碼值。該回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），相關系數R2=0.982 7，這表明其擬合度和可信度均很高，實驗中98.27%的變異可由該模型進行解釋。

表3 Plackett-Burman 試驗設計與結果Table 3 The design and results of Plackett-Burman design for the production of Monacolin K

方程系數的方差分析結果如表4 所示。

表4 Plackett-Burman 試驗回歸分析結果Table 4 Results of the Plackett-Burman design regression analysis for the production of Monacolin K

培養基含水量（X1）與接種量（X3）對Monacolin K產量的影響達到了極顯著水平（P＜0.01），為正效應，裝瓶量（X2）為顯著水平（P＜0.05），是負效應；但其它各因素的影響均不顯著（P＞0.05）。顯著性因素（X1、X2與X3）將采用響應面法進一步優化。非顯著性因素中X4為負效應，后續實驗直接采用Plackett-Burman 設計中的低水平為最佳水平，即pH 5；X5、X6、X7為正效應，但因為其為非顯著因素，考慮到生產上節約成本，后續實驗也直接采用Plackett-Burman 設計中的低水平為最佳水平，即28 ℃、葡萄糖1%（質量分數）、蛋白胨1%（質量分數）。

2.4 Box-Behnken 中心組合試驗

根據Plackett-Burman 試驗選出的顯著因素，對X1、X2和X3采用3 因素3 水平的響應面分析方法進行發酵條件的優化。為使擬合方程具有旋轉型和通用性，中心點重復5 次。實驗設計及結果見表5。利用Design Expert 7.1 統計軟件對表5 實驗數據進行回歸擬合，二次回歸模型的方差分析見表6。

通過Design Expert 7.1 軟件對表5 的實驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得Y 對X1（培養基含水量）、X2（裝瓶量）和X3（接種量）3 個因素的二次多項式回歸方程為：

表5 響應面分析實驗設計和結果Table 5 Experimental design and results of Box-Behnken designed experiments for the production of Monacolin K

表6 二次回歸模型的回歸分析結果Table 6 Regression results from the data of Box-Behnken designed experiments

式中：Y 為Monacolin K，（mg/g）；X1、X2與X3為自變量的編碼值。

由表6 方差分析可知，回歸模型極顯著（P＜0.01）、失擬項不顯著（P ＞0.05）、模型相關系數R2=0.959 0，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，能夠很好的對Monacolin K 的發酵工藝進行預測。由回歸模型系數顯著性檢驗結果可知，模型的一次項（X1、X2）、交互項（X1X3、X2X3）與二次項對Monacolin K 產量的影響顯著（P＜0.05），而一次項X3與交互項X1X2影響不顯著（P＞0.05）。表明各影響因素對產Monacolin K 的影響不是簡單的線性關系。由二次回歸方程可知，二次項系數為負，說明拋物面開口向下，有最大值。求解二次回歸方程，可求出各因素的最佳水平（編碼值）：X1=-0.45、X2=-0.75、X3=0.26，解碼后可得其真實值，即：培養基含水量42.77%（mL/g）、裝瓶量46.26 g/（250 mL 三角瓶）、接種量8.52%（mL/g）。在此最佳條件下，模型預測的Monacolin K 的最大值為14.37 mg/g。為驗證模型預測結果的準確性，采用上述最佳條件進行了3 次驗證實驗，實測值為（14.03±0.53）mg/g，與預測值十分接近，這說明該模型是準確有效的。

為了更直觀地描述X1、X2和X33 個因素對響應值的影響，利用Design Expert 7.1 軟件繪制各因子對Monacolin K 的響應面圖，如圖5 所示，響應面存在最大值，即為模型所預測的最佳水平點。

2.5 發酵時間對干重減重和Monacolin K 產量的影響

圖5 培養基含水量、裝瓶量與接種量影響Monacolin K 產量的響應面圖Fig.5 Response surface plot for the production of Monacolin K in terms of the effects of initial moisture content，bottle load and inoculation

圖6 發酵時間對干重減重和Monacolin K 產量的影響Fig.6 Effect of incubation time on the dry matter weight loss and production of Monacolin K

發酵時間對干重減重和Monacolin K 產量的影響如圖6 所示，前3 天菌體生長處于延遲期，基質干重減重很小，幾乎沒有Monacolin K 產生；3 d～12 d 菌體生長進入對數期，干重減重迅速增加。發酵前期（0 d～3 d）Monacolin K 僅有少許產生，但在發酵中后期（5 d～12 d）Monacolin K 大量產生。12 d 后，基質的干重減重和Monacolin K 的增長速度均逐漸減慢，在第14 天時，Monacolin K 的產量達到最高，為（16.67±0.36）mg/g。

3 結論

本文通過單因素試驗、Plackett-Burman 與Box-Behnken 試驗設計對紅曲霉MY-01 固態發酵生產Monacolin K 的工藝條件進行了系統優化，確定了其最佳生產工藝：培養基含水量42.77%（mL/g）、裝瓶量46.26 g/（250 mL 三角瓶)、接種量8.52%（mL/g）、pH 5、葡萄糖1%（質量分數）、蛋白胨1%（質量分數），于28 ℃恒溫培養14 d，Monacolin K 含量可達（16.67±0.36）mg/g，比基礎培養基提高了47.7%。此發酵水平遠高于目前文獻報道的Moancolin K 固態發酵的生產水平[9，16-18]，對Moancolin K 的工業生產具有一定的指導意義。

[1]Hsin-Ping Ou,Chiun-C R Wang,Lih-Shiuh Lai.Thermal degradation kinetics analysis of Monacolin K in Monascus-fermented products[J].LWT-Food science and technology,2009,42(1)：292-96

[2]Valera HR,Gomes J,Lakshmib S,et al.Lovastatin production by solid state fermentation using Aspergillus flavipes[J].Enzyme and microbial technology,2005,37(5)：521-26

[3]Seraman S,Rajendran A,Thangavelu V.Statistical optimization of anticholesterolemic drug lovastatin production by the red mold Monascus purpureus[J].Food and bioproducts processing,2010,88(2/3)：266-76

[4]Chang Y N,Huang J C,Lee C C,et al.Use of response surface methodology to optimize culture medium for production of lovastatin by Monascus rubber[J].Enzyme and microbial technology,2002,30(7)：889-894

[5]Jones K D,Couldwell W T,Hinton D R,et al.Lovastatin induces growth inhibition and apoptosis in human malignant glioma cells[J].Biochem Biophys Res Commum,1994,205(3)：1681-1687

[6]張萍,糜漫天,韋娜,等.洛伐他汀對MCF-7 細胞pRb 蛋白表達及增殖功能的影響[J].中國公共衛生,2002,18(10)：1198-1200

[7]丘振宇,王亞琴,許喜林.紅曲霉中Monacolin K 的應用研究[J].中國釀造,2007(5)：4-6

[8]徐偉,王金鳳,易曼.紅曲霉玉米發酵產Monacolin K 最佳條件研究[J].哈爾濱商業大學學報：自然科學版,2008,24(2)：207-209

[9]董文賓,陶璐,張建華,等.紅曲霉菌固體發酵產Monacolin K 工藝的優化[J].現代食品科技,2007,23(8)：32-35

[10]季宏飛,許楊,李燕萍.采用響應面法優化紅曲霉固態發酵產紅曲色素培養條件的研究[J].食品科技,2008,33(8)：9-13

[11]童振宇,周立平,陳旭峰.響應面法優化紅曲霉菌株Monacus purpureus WX 液態發酵產Monacolin 工藝條件[J].浙江工業大學學報,2007,35(1)：35-40

[12]邱源,周立平,嘉曉勤.紅色紅曲菌液態發酵產Monacolin K 重要影響因素的研究[J].釀酒科技,2010(5)：47-50

[13]甘鋒,唐建忠,王軒,等.響應面法優化紅曲霉固態發酵產Monacolin K 工藝條件的研究[J].中國食品添加劑,2011(1)：131-136

[14]李鐘慶,楊曉暾,郭芳.綜觀紅曲與紅曲菌[M].北京：中國輕工業出版社,2009：9-10

[15]Terebiznik MR,Pilosof AMR.Biomass estimation in solid state fermentation by modeling dry matter weight loss[J].Biotechnology techniques,1999,13(3)：215-219

[16]魏培蓮,周立平,岑沛霖.紅曲霉固態發酵產Lovastatin 的培養條件[J].食品與發酵工業,2004,30(4)：32-35

[17]熊曉輝,張李陽,韋策,等.紅曲霉菌產Monacolin K 固體發酵條件的優化[J].無錫輕工大學學報,2004,23(1)：9-13

[18]董永勝,劉同軍,賈士儒.紅曲霉固態發酵生產Monacolin K 工藝條件的研究[J].食品研究與開發,2007,28(6)：27-30