紅小豆生物技術研究進展

高義平 董福雙 王海波

（1. 河北省農林科學院遺傳研究所 植物轉基因中心，石家莊 050051；2. 保定市農業科學研究所，保定 071000）

紅小豆是豆科（Leguminosae）、豇豆屬（Vigna）中的一個栽培種（V.angularis），其籽粒高蛋白、中淀粉、低脂肪，營養豐富，具有食藥兼用的價值，隨著人們消費水平的提高，越來越受到消費者青睞。早期研究認為紅小豆起源于中國。我國紅小豆種植歷史悠久，種質資源豐富，年種植面積和總產量一直位居世界首位。關于紅小豆生物技術的研究和應用，日本起步較早，我國的研究和應用起步晚，基礎薄弱，大部分工作還集中在種質資源的分子標記鑒定方面，研究的深度和廣度都有待加強。本文是從分子水平和細胞水平上對紅小豆生物技術方面的最新研究、應用進展進行了總結，以給紅小豆遺傳、育種工作者提供參考。

1 紅小豆DNA水平的研究

紅小豆DNA水平上的研究主要集中在利用分子標記技術對紅小豆的起源、傳播、進化、種質資源的遺傳多樣性、不同地域栽培型、半野生型、野生型小豆的變異程度及其相互之間親緣關系的遠近等方面的研究，遺傳圖譜構建、基因克隆與轉化等工作相對較少。

1.1 種質資源鑒評和起源的研究

應用分子標記對小豆種植資源鑒定評價和起源的研究最早始于1993年，Kaga等［1]應用RAPD標記將一個豇豆品種與12個小豆栽培品種區分開，后來Yee等［2]用RAPD和AFLP標記對來自中國、日本、韓國的58個品種進行遺傳多樣性分析，發現小豆種間遺傳多樣性豐富，可以保證小豆種內遺傳圖譜群體的成功構建。之后國內外很多學者相繼開展了分子標記技術應用于小豆遺傳、育種的基礎性研究，尤其是種質資源的遺傳多樣性研究。

1.1.1 關于小豆起源的研究 瓦維洛夫在《主要作物的世界起源中心》一書中，將中國的中部和西部山區及其比鄰的洼地列為小豆的起源中心。隨著分子技術的興起，利用分子標記手段尋求小豆起源、進化的證據成為早期起源研究的課題之一。葉劍等［3]利用SSR引物對來自中國、日本、韓國、不丹、越南5國的104份栽培小豆種質資源的研究表明，中國西南地區的栽培小豆種質存在較豐富的遺傳多樣性，初步認為我國西南地區可能是小豆的一個起源中心和遺傳多樣性中心。宗緒曉等［4]用12對AFLP引物對來自6個國家的146份小豆栽培型和野生型種質進行遺傳多樣性分析，結果認為中國、日本群島、喜馬拉雅山西側地區，應均為紅小豆的起源中心，初步肯定了栽培小豆的多起源中心觀點，向中國唯一起源中心說提出質疑。

1.1.2 關于小豆進化的研究 關于栽培小豆的進化來源目前還沒有定論。Xu等［5]、金文林等［6]利用RAPD標記研究顯示，遺傳變異程度由高到低依次為野生小豆、半野生小豆和栽培小豆，小豆的進化是由野生到半野生到栽培型的過程，然而也有研究認為栽培小豆來源于野生小豆，除了二者染色體數目相同、雜交可行外，Xu等［7]、Mimura等［8]進一步用分子標記研究遺傳多樣性的結果也支持了這一觀點。關于半野生小豆的來源Yamaguchi提出了3種假設，一是野生種和栽培種之間的進化產物；二是古老栽培種的退化種；三是栽培種與野生種的雜交衍生物［9]。研究結果的差異可能因研究材料的不同而引起［10]。

1.1.3 關于遺傳多樣性的研究 宗緒曉等［4]、粟生群等［11]、佘躍輝等［12]分別利用不同的分子標記對我國栽培型小豆種質資源遺傳多性進行檢測，結果均證明：我國小豆栽培型種質間存在較豐富的遺傳多樣性；RAPD、AFLP、RAMP等分子標記均可檢測到較高的多態性，可以作為小豆遺傳圖譜構建、種質鑒定和分類以及新品種保護的有效工具。

1.2 遺傳圖譜構建

小豆的第一張分子標記遺傳圖譜是1996年由Kaga等［13]利用兩個栽培品種的F2家系建立的。2000年，Kaga等［14]用栽培品種和飯豆品種的F2家系建立了一個相對完善的遺傳圖譜。2005年，Han等［15]以日本地方品種與尼泊爾野生種的BC1F1群體為作圖群體，構建了一張中等飽和度的小豆遺傳連鎖圖，這也是迄今為止飽和度最高的小豆連鎖圖譜。Isemura等［16]和Kaga等［17]再次分別建立了兩個遺傳圖譜，并標記了多個數量性狀基因（表1）。

Chaitieng等［18]比較了小豆和豇豆的連鎖圖譜，研究表明小豆和豇豆分子標記排列順序高度保守，但在進化過程中兩個種之間基因組發生了倒位、插入、缺失、重復和易位現象，第1、2、5連鎖群發生倒位，小豆第1連鎖群與豇豆第10連鎖群部分區域一致，兩個物種的SSR等分子標記可以通用。

表1 紅小豆遺傳圖譜的構建情況

1.3 基因克隆

小豆基因克隆工作多以其他作物相關基因序列來設計引物進行。Zheng等［19]根據其他作物ABA-Gpase設計兼并引物，從cDNA文庫克隆，與誘導ABA-Gpase進行Northernblot雜交，從小豆的幼苗中克隆并鑒定了一個ABA-葡萄糖基轉移酶基因。劉燕等［20]根據大豆、豌豆等植物的鐵蛋白基因序列設計簡并引物，利用RACE延伸技術獲得紅小豆鐵蛋白基因的cDNA 全長序列，將攜帶該基因的表達載體通過基因槍轉化法轉入水稻。對轉基因水稻葉片的PCR檢測和鐵含量測定證明，目的片段已經整合到水稻基因組中。陳新等［21]根據豇豆PR基因、四季豆PvPR1、PvPR2基因及綠豆PR10基因的保守區域設計簡并引物，以小豆cDNA為模板進行PCR擴增，克隆到了PR類抗病基因VaPR3。Kouichi 等［22]通過對小豆下胚軸在不同處理時間300 G超重力時VaKTN1（劍蛋白基因）轉錄水平的研究顯示，15 min內VaKTN1轉錄水平增加，45 min時轉錄水平達到最大值，2 h時這一水平降至正常水平范圍。

1.4 遺傳轉化研究

小豆的遺傳轉化工作多圍繞小豆籽粒的抗豆象工作展開。Yamada等［23]以pSG65T為基因載體、根癌農桿菌EHA105為侵染菌株、卡那霉素為抗性篩選基因、gfp為報告基因，研究了小豆的上胚軸的轉化效率，得到了2%的轉化率。Chen等［24]利用農桿菌介導法把綠豆品種（Vc6089A）抗豆象基因VrD1轉入到當地栽培小豆中，得到了成功表達；Matusim等［25]通過pZHBG質粒攜帶、農桿菌EHA105介導轉化小豆上胚軸，將抗豆象基因轉化到日本北海道栽培小豆品種中，經Southern雜交檢測到了31個轉化植株，轉化率14%；Nishizawa等［26]將來源于普通菜豆的α-淀粉酶抑制劑2（αAI-2）基因，通過農桿菌介導轉入小豆，Southern雜交結果顯示獲得了3個整合方式不同的穩定品系。免疫印跡分析顯示，αAI-2基因在轉基因小豆種子中得到了表達。轉基因小豆與普通菜豆具有相同的α-淀粉酶的抑制特異性。通過小豆象鼻蟲侵害試驗，3個轉基因小豆品系具有了極高的抗性水平。

2 紅小豆細胞水平的研究

2.1 組織培養、胚拯救及原生質體培養

20世紀80年代是紅小豆組織培養研究的密集期。魯明塾等［27]通過MS+1.0 mg/L ZT+500 mg/L LH誘導愈傷組織培養基、MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+ 500 mg/L LH誘導愈傷分化成苗培養基、MS+500 mg/L LH誘導幼苗生根培養基將小豆子葉外植體通過愈傷途徑再生成苗；許智宏［28]將小豆上胚軸在添加生長素的MS培養基上直接再生成苗；Ozaki［29]將MS培養基上誘導的致密型愈傷在MS+0.2或1.0 mg/L BA的培養基上誘導成苗；金文林［30]用小豆幼根、上胚軸、初生葉、子葉等幾種外植體都誘導出了良好的愈傷組織，上胚軸在MS+6-BA培養基上不通過愈傷途徑直接再生成苗。

胡英考［31]開展了小豆與飯豆的雜種幼胚胚拯救研究，其中以小豆為母本的11 d以上的幼胚，在MS和MB（MS無機+B5有機）基本培養基、添加1.0 mg/L IAA和0.2 mg/L KT的兩種培養基上，獲得了13個植株，但幼苗移栽后死亡，沒有得到開花結實植株。

小豆原生質體再生植株成功的報道有兩例。黃培銘和葛扣鱗［32]將葉肉原生質體愈傷組織分化成苗；Sato等［33]用北海道小豆栽培品種誘導原生質體，再通過原生質體培養誘導成苗，并獲得了再生苗的種子。所用的培養基有：MS+2.0 mg 2，4-D固體培養基誘導上胚軸愈傷；同樣培養基的液體誘導懸浮細胞系；1%纖維素酶+0.1%果膠酶+1.5%溶解酶+0.4 mol/L甘露糖醇的CPM鹽溶液（即將纖維素酶、果膠酶、溶解酶、甘露糖醇全部溶解于CPM鹽溶液）破壁獲得原生質體；原生質體在MS+1.0 mg /L 2，4-D+1.0 mg/L BAP固體培養基上培養、在MS+1.0 mg/L BAP +0.1 mg/L IAA上誘導出芽成功。

2.2 染色體核型分析

小豆染色體在豇豆屬中相對較小，不易觀察，細胞遺傳學的研究報道較少。郭淑華等［34]選用4個北京地方小豆種質進行了染色體核型分析，確定其染色體數目2n=22，染色體核型為2n=14M+6SM+2Sat，但參試材料間染色體組型無明顯差異。金文林等［35]用60Co-γ射線處理小豆風干種子后，對小豆根尖染色體畸變率進行了觀察，發現γ射線照射造成小豆根尖染色體橋和斷片頻率較高。

佘躍輝［36]于2005年應用改良ASG法對12個小豆種質染色體的核型進行了比較分析，并對3個小豆種質染色體進行了G-帶帶型的初步觀察，結果表明，12份小豆種質在染色體形態特征上存在差異，其核型組成上有6種類型，分別為：2n=22=20m+2sm，2n=22=18m+4sm，2n=22=16m+6sm，2n=22=16m+6sm（2Sat），2n=22=14m+8sm，2n=22=14m+8sm（2Sat），核型類型上分為1A和2A兩種類型。G-帶帶型分析表明，同源染色體的帶紋數目、分布位置、染色深淺基本一致，可以較準確地進行染色體配對；非同源染色體的帶型有明顯差異，可以準確區分。不同種質間在G-帶帶型上存在多態性，反映了小豆各種質之間在遺傳結構上的差異，揭示出小豆種在染色體結構上存在著多樣性。

3 小結

在細胞水平上，首先，雖然前人有過成功的愈傷組織、原生質體再生成苗經驗［27，33]，但目前國際上仍沒有一種快速獲得組培苗材料的方法，愈傷組織再生成苗、原生質體再生成苗等技術還不成熟。把一個品種通過組培途徑再生成苗需要幾個月甚至1-2年的摸索，而且遇到難培養類型還往往不能成功。這使得小豆的轉基因技術應用受到很大限制；其次，遠緣雜交雖可為育種創造巨大的增產及抗病潛力，但胚拯救、原生質體融合等技術在小豆上仍是一道難關，這使得遠緣雜交在育種上的應用也受到很大限制。

在分子水平上，還沒有足夠多的引物用于品種鑒定、基因克隆和分子標記輔助育種。目前應用于小豆研究的分子標記主要是RAPD和AFLP，而有關小豆SSR標記目前報道的只有幾十對引物［37，38]。

小豆生物技術研究有很多工作，但急需的是以應用基礎研究為主，加強細胞水平、分子水平的研究，即建立遠緣雜交的支撐技術體系，建立細胞培養的再生技術體系；開發育種需求高的與抗性、適應性、品質等性狀緊密連鎖的分子標記；標記控制小豆重要農藝性狀的基因；構建高密度的小豆分子連鎖圖譜，從而通過遠緣雜交、遺傳轉化和MAS等手段使小豆的育種和遺傳學研究能上一個新臺階。另外，從事小豆基礎研究和育種的機構和人員相對較少，因此開展國際交流與合作十分必要。若此，將會對小豆的基礎和應用研究以及在世界上更大范圍生產起到很大作用。

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