渦蟲的基因沉默作用

吳雪 袁金鐸 趙楠楠 楊桂文 安利國

（山東師范大學生命科學學院 山東省動物抗性生物學重點實驗室，濟南 250014）

基因沉默（Gene silencing）作為生物學研究的新領域，吸引了無數生物學家的眼球，在近20年間有許多關于這一方面的研究及假說被提出。基因沉默現象最早是Napoli 等發現，他們在進行轉基因紫牽牛花的研究中意外發現白色花和雜色花表型，后來證實該表型是由轉基因誘導植物體內基因功能缺失所致，當時稱這種現象為共抑制。1995年，Guo等［1]在對秀麗新小桿線蟲進行反義RNA技術的研究時，也出現了同樣的抑制現象。直至1998年，Fire等［2]將dsRNA導入線蟲體內，檢測該dsRNA對線蟲的影響，結果證實外源dsRNA會使特定基因沉默，并且該沉默作用具有遺傳特性。他們將這種現象定義為RNA干擾作用（RNA interference，RNAi），也稱為轉錄后基因沉默作用（Post transcriptional genesilencing，PTGS）。

在發現 RNAi作用后的幾年間，該技術作為熱點課題在多種生物中開展研究。在真菌、果蠅 、擬南芥等生物體內相繼發現了RNA i現象的存在［3]。1999年，再生模型渦蟲體內也發現了相同的基因沉默作用［4]，自此，RNAi作為一項能有效誘導特定基因功能缺失的新興技術，在渦蟲發育生物學和分子生物學的研究中發揮重要作用。近年，科學家研究發現內源性小RNA同樣可以引起渦蟲的基因沉默現象——miRNA、piRNA［5]，這種內源性基因沉默作用涉及渦蟲生命活動的整個過程，如胚胎發育、干細胞維持、組織再生和配子形成等等，是渦蟲維持正常生命活動所必須的調控過程。但目前對于miRNA、piRNA的作用機制還不是很清楚，尚需進一步試驗研究來證實。

1 渦蟲RNA干擾作用

1.1 RNA干擾機制

近年來對于RNAi技術的研究發現，在此過程中主要有幾個控件發揮著重要作用，使得RNA干擾賴以發生。（1）雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）——觸發分子；（2）干擾性小RNA（small interfering RNA，siRNA）——重要效應分子；（3）RNaseⅢ家族核酸酶（Dicer，DCR）——dsRNA剪切酶；（4）RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）—— 沉默誘導物；（5）RNA依賴的RNA聚合酶（RNA directed RNA polymerase，RdRP）——級聯放大效應酶。RNAi 發生機制大致分為3個階段，即啟動階段：dsRNA進入生物體內，會被細胞內的Dicer酶識別并在ATP供能的條件下剪切成長約 21-24個核苷酸（Nucleotide，nt）的片段，即siRNA。效應階段：siRNA與 Dicer酶、Argonaute蛋白家族等分子結合形成RISC，但此時的RISC處于無活性狀態，無活性的RISC需在核酸內切酶 Ago-2的作用下使siRNA解旋，解旋后的反義鏈RNA將作為“向導”指導RISC識別靶mRNA。最終，RISC在Ago-2協助下降解靶mRNA，引發基因沉默［3，6]（圖1）。 級聯放大系統：由Dicer酶切割而成的siRNA除了與作用因子結合形成RISC之外，還能在RdRp的作用下，以靶mRNA為模板合成dsRNA，這些新合成的dsRNA最終也可被剪切成大量的siRNA，從而放大由siRNA引發的基因沉默作用，因此即使是很微量的dsRNA也能產生比較徹底的基因沉默效應［7，8]。

1.2 RNA干擾技術在渦蟲中的發現

渦蟲以其驚人的再生能力聞名于世，早在1989年，Morgan等［9]就已發現即使將渦蟲切成279段，其每一截段也可以再生成一個完整的個體，證實了渦蟲強大地再生能力。除此之外，渦蟲作為具有三胚層、左右對稱、頭部集中化等特性的最簡單生物體，在后生動物的進化過程中占據重要地位［10]。在過去的一個世紀里，渦蟲作為經典的模型生物，為后生動物乃至人類生物學難題的解答提供了重要的參考依據，尤其是渦蟲再生機制的研究，對于脊椎動物再生模型的建立具有重要意義［11]。但是由于缺乏行之有效的技術，渦蟲的很多相關研究只局限在形態學和細胞學水平上，無法深入展開，因此科學家們花費大量的精力探索新的技術用于渦蟲的深入研究。

1998年，科學家們在比渦蟲高等的線蟲中發現了RNAi作用，主要通過dsRNA注射法進行干擾。為了檢測這種方法是否會在渦蟲體內引發同樣的基因沉默現象，Alvarado等［4]選取了體壁肌肉組織、具纖毛的腹部上皮組織、光感受器3個渦蟲易于檢測的代表性部位進行RNAi測定試驗。研究結果表明：dsRNA注射法在渦蟲體內會引起同樣的基因沉默效果；dsRNA注射法在渦蟲體內所引發的基因沉默效應是特異的；dsRNA在渦蟲體內通過降解靶mRNA致使基因功能喪失。Alvarado的試驗結果作為一個強有力的證據，證實了RNAi技術在渦蟲體內發揮的強大功效，為RNAi技術在渦蟲生物學研究中的應用奠定了基礎。

隨著RNAi作用在渦蟲中的發現，很多科學家對該領域產生了濃厚的興趣。他們嘗試用一些改良的方法來誘導渦蟲體內的基因沉默作用，如dsRNA飼喂法和siRNA浸泡法，都較為成功的起到了基因干擾作用［10]。在之后的10多年時間里，dsRNA注射法與dsRNA飼喂法作為渦蟲RNAi技術的主要方法，在渦蟲基因功能和再生機制的研究中發揮著無法替代的作用。

1.3 RNA干擾技術在渦蟲中的應用

RNAi技術的應用，克服了渦蟲研究技術的局限性，為渦蟲基因功能的研究準備了條件。2005年，Reddien等［12]在EST庫的基礎上，結合RNAi技術，建立了第一個以siRNA干擾基因功能為基礎的渦蟲RNAi基因篩選文庫。這一文庫的建立為渦蟲更好地作為模型生物在發育生物學研究中發揮作用奠定了基礎，同時也掀起了渦蟲基因水平研究的新高潮，此后，科學家們積極開展渦蟲RNAi的相關研究。

1.3.1 渦蟲RNAi多樣化表型的確定 Reddien等［5]建立的RNAi基因篩選文庫中，對瑞士種渦蟲進行代表性取樣，選取53 400個渦蟲截段，干擾1 065個基因，共篩選出240個代表性表型類別，用于渦蟲再生和穩態的研究。對這240個基因進行分析發現，其中的大部分基因在進化上存在高度的保守性——205個（85%）基因在其他生物體的基因組中發現了序列相似的同源基因。例如，渦蟲中有38個基因的編碼序列與人類某些疾病的引發序列存在同源性，在渦蟲中對這些基因進行深入研究，有望開發出治療人類相關疾病的藥物，并且渦蟲特定基因干擾表型易于獲得，這也為相關疾病基因的研究提供了便利的條件。另外，還有35個無任何進化保守性的渦蟲基因，這些基因被認為是扁形動物維持自身生命活動所必需的看家基因，在很多扁形綱的病原蟲中這些基因也起至關重要的作用。因此可以針對這些已知的病原基因，設計相應有效的生物制劑，用于疾病的防御和治療。渦蟲RNAi多樣化表型的確定，是渦蟲基因功能研究的先決條件，為特定疾病的控制和治愈提供了有效信息，為疾病的檢測技術提供了強大后盾［13]。

1.3.2 RNAi在渦蟲neoblast研究中的應用 Neoblast即渦蟲成體干細胞，主要存在于渦蟲的間充質區，是渦蟲體內唯一具有增殖分裂活性的細胞，渦蟲的neoblast占其細胞總數的20%以上，因而可作為模式生物用于干細胞的研究［14]。在RNAi機制被發現之前，主要是通過紫外照射法特異性殺傷neoblast，但紫外線的殺傷作用具有非特異性，因此無法對neoblast的特定基因進行專門研究。而Reddien［5]通過RNAi作用篩選出導致neoblast表型異常的基因——異常表型與紫外照射的渦蟲截段表型相似。再對這些篩選出的基因進行分組干擾試驗，從而確定出neoblast發生相關的關鍵基因：smedwi-2和smedwi-3［15]。近年，Salvetti等［16]用相同的RNA干擾方法在渦蟲體內檢測到果蠅Pumilio的同源基因DjPum，該基因對于neoblast數量和形態的維持起重要作用。Guo等［17]將渦蟲干細胞中的Bruno-like基因干擾后，neoblast將不能進行自我更新。除此之外，在瑞士種渦蟲中還發現vasa、piwi、tudor和nanos的同源基因，這些基因功能的缺失會引起neoblast數量的明顯減少，表明它們是維持neoblast活性所必需的［18]。neoblast相關基因的發現為成功分離和培養渦蟲干細胞準備了條件，為人類更好地了解干細胞的調控機制提供了有價值的線索［19]。

1.3.3 RNAi在渦蟲再生研究中的應用 渦蟲的再生過程主要伴隨著胚基發生和neoblast分化而進行，所有與neoblast的發生分化相關的基因在渦蟲的再生過程中都起著重要作用，除此之外，再生過程中還涉及很多其他基因的相互作用，是一個非常復雜的基因調控過程。將RNAi文庫中已鑒定出的240個干擾表型，按截段的再生階段和胚基大小進行分類，針對各分類表型中的相應基因進行功能測定，從而確定出再生過程中各階段的關鍵作用因子。Cebrià等［20]通過干擾roboA基因，發現神經系統在調控渦蟲前端形態發生過程中起關鍵作用，神經系統相關基因干擾后，出現前端再生異常表型。Lapan［21]發現渦蟲眼點再生過程中的關鍵調控因子——ovo，OVO缺少時渦蟲無法形成正常的眼點結構。FGF-like受體nou-darake基因被認為可能與渦蟲頭部再生有關，該基因敲除后，可誘導渦蟲的其他部位形成異位的大腦和眼點［22]。此外，Kobayashi和Iglesias等［23，24]通過對DjwntA基因的干擾作用證實：Wnt在渦蟲再生過程前后軸極性的確立中起關鍵作用，并且發現了DjwntA和nou-darake/FGFR信號通路間的相互作用。通過分析這些已確定的再生因子，科學家們正逐步建立起渦蟲的再生模型。該模型的建立有助于闡明高等動物細胞分化及器官再生的分子機制，將給人類疾病的治療、組織器官損傷的修復帶來新的希望。

2 渦蟲內源性基因沉默

2.1 miRNA介導的內源性基因沉默

近年，在渦蟲中發現另一條引發基因沉默的途徑。該途徑的主要效應因子為miRNA（microRNAs）：miRNA與siRNA同為20-25 nt單鏈小分子RNA，但與外源性干擾siRNA所不同，miRNA是由內源性具發夾結構的 pre-miRNA 加工而成，因此該過程又稱為內源性基因沉默作用。基因組中位于內含子或基因間隔區的非編碼基因經RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成pri-miRNA，pri-miRNA在Drosha及其輔助因子DGCR8/PASHAR的作用下去除帽、尾結構成為pre-miRNA［25，26]，再經Dicer 酶切割成 20-25 nt的miRNA：miRNA*配對分子，最終成熟的miRNA 從miRNA：miRNA*雙體中分離出來，與Argonaute蛋白結合形成沉默誘導復合體并進行靶基因識別，從而誘發內源性基因沉默作用［27，28]。近來的研究結果表明，miRNA 在轉錄后調控中起著至關重要的作用，miRNA介導的內源性基因沉默作用涉及渦蟲生命活動的整個過程，如胚胎發育、形態發生、干細胞維持及組織再生等是渦蟲維持正常生命活動所必須的調控過程［29]。

渦蟲體內已發現了多種基因，它們與其他物種中編碼miRNA發生相關蛋白的基因同源，當被敲除時會導致渦蟲再生過程的異常，表明miRNA在渦蟲再生和neoblast維持過程中是必須的。例如，Ago-2作為渦蟲形成沉默誘導復合體的必需蛋白，被RNAi技術沉默后，不僅阻礙了再生過程，而且neoblast的數量也出現了明顯的下調［30，31]。目前，在瑞士種渦蟲中已鑒定出很多保守的miRNA和miRNA簇，預測這些miRNA在渦蟲中具有相似功能。對渦蟲miRNA進行高通量測序，發現了兩類miRNA：strain-specific miRNA和neoblast-specific miRNA［32]。

2.1.1 strain-specific miRNA 瑞士種渦蟲具有有性品系和無性品系兩種，有性品系成熟個體同時具有雌性生殖系統和雄性生殖系統，即雌雄同體。而無性品系缺少成熟的生殖器官，只能進行裂體生殖。Newmark［9]對兩品系進行核型分析，發現無性品系中的染色體易位現象可能是導致其無法產生成熟生殖器官的根本原因。通過高通量測序對兩品系的miRNA進行分析，尋找出很多品系特異miRNA，其中大部分的無性品系miRNA為渦蟲所特有的［33]。雖然這些特異miRNA與染色體易位現象間的關系還不是很清楚，但可以確定它們確實在渦蟲品系分化中發揮作用，這些miRNA的發現為渦蟲生殖模型的建立準備了條件。

2.1.2 neoblast-specific miRNA 通過對紫外處理組和非處理組渦蟲miRNA進行高通量測序，鑒定出許多在neoblast中特異表達的miRNA。例如，miRNA簇mir71a/2d/13/752中的41個miRNA進行整體原位雜交，雜交痕跡主要定位在神經系統和上皮組織的neoblast中［33，34]。渦蟲中有斑馬魚mir-133的同源基因，Wnt 和Fgf是該基因的主要作用靶點——它們是渦蟲傷口愈合、干細胞再生及前后軸極化所必需的［35]。最近的研究顯示，渦蟲miRNA可能在中樞神經系統發育過程中起重要作用，因為很多渦蟲miRNA的作用靶點是中樞神經系統再生過程中的關鍵因子，但這些特異miRNA對神經鏈接進行再生修復的調節機制還不清楚。

2.2 piRNA介導的內源性基因沉默

2006年，《Nature》和《Science》雜志同時刊載了關于piRNA分子的報道。piRNA是一種26-31nt組成的內源性單鏈小RNA，主要分布在轉座子、重復序列等區域。可通過Piwi-piRNA復合物引起基因沉默從而調控生殖細胞的生長發育過程，是多種生物生殖發育得以順利進行的重要保障［36-38]。piRNA最早在雄性小鼠睪丸中發現，這些小RNA特異地與Piwi 蛋白家族的成員相互作用，因而被命名為 Piwiinteracting RNAs，即 piRNAs［39]。隨后，Reddien在渦蟲中也發現了piRNA。它們可與渦蟲的Piwi同源蛋白Smedwi-2、Smedwi-3相互作用。Smedwi蛋白家族在維持渦蟲干細胞性能中起作用，piRNA可通過沉默Smedwi-2、Smedwi-3的表達來完成對干細胞形態數量的調控［15]。渦蟲piRNA在染色體上的分布位置具有保守性。同時，其形成過程也遵循其他物種所適用的“乒乓模型”（ping pang model）假說。2008年，Palakdoeti［15]證實，渦蟲piRNA確實具有與其他物種piRNA相似的功能，即piRNA在渦蟲生殖干細胞命運決定、減數分裂、精子發生等配子形成事件中發揮重要作用［34]。目前，對于渦蟲piRNA的研究較少，對其分子特征及作用機制還不是很清楚。有人認為，piRNA能通過表觀遺傳調控及轉錄后調控的方式發揮基因沉默作用［40，41]，但尚需進一步探究考證。

3 結語

RNA干擾技術在渦蟲的基因功能研究中有著廣泛的應用，對其機制和功能的研究比較透徹。miRNA 和piRNA 介導的內源性基因沉默作用作為一種重要的調節機制，在渦蟲新陳代謝、生長發育、繁衍后代的過程中發揮重要作用。但目前對于這些小RNA的研究較少，對它們的作用機制和功能特性還不是很清楚。在未來的試驗中，可以應用新的測序技術對不同再生階段中的各類細胞和組織進行小RNA表達檢測。同時，利用定點監測技術明確miRNA和piRNA的作用靶點，從而建立起渦蟲小RNA 在干細胞維持及再生調節中的作用模型。另外，在生物體中還檢測到許多其他非編碼小RNA的存在。如snoRNAs和lncRNAs［42]，它們可調節哺乳動物的發育過程，猜測在渦蟲中也具有相似的功能，可通過進一步的試驗進行證實。

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