土壤桿菌ATCC31749合成可德膠的研究進展

余小琴 吳毅歆 何月秋 毛自朝

（云南農業大學農學與生物技術學院，昆明 650201）

可德膠（Curdlan）是一種由D-葡萄糖以β-1，3-糖苷鍵線性連接而成的中性多糖［1]。可德膠溶液在加熱冷卻后可以形成不同性質的膠體：加熱60℃可以形成低固膠，加熱到80℃可以形成高固膠［2]。因其獨特的凝膠特性被廣泛應用于農業、建筑及化工行業等多個領域。如在食品、化妝品等加工過程作為添加劑，其抗HIV、抗腫瘤、提高免疫力活性等特性使其具有廣闊的醫用前景［3-5]。目前全球可德膠產品約有50億美元的市場份額，并預計以每年10%左右的需求速度增長。

可德膠可由細菌、真菌和植物等生物體合成，商用可德膠主要由農桿菌（Agrobacteriumspecies）及其衍生菌株發酵產生。土壤桿菌 ATCC31749（Agrobacteriumsp.ATCC31749）是一種革蘭氏陰性細菌，菌體形態呈桿狀，是可德膠發酵生產及研究的優良模式菌株［6]。土壤桿菌 ATCC31749的可德膠代謝是一個復雜的體系，外界環境對其基因的轉錄和蛋白質的表達有直接影響。大量試驗表明，微生物利用糖質原料發酵時明顯受到培養基中氮源條件的影響，土壤桿菌ATCC31749必須在氮源耗盡的條件下才能合成可德膠，而氮素充足時只進行的是正常的葡萄糖代謝途徑［7，8]。但土壤桿菌 ATCC31749 的生長期與產膠期是非偶聯的，因此可以采用兩階段發酵的方法提高產量。即第一步在正常氮源條件下增殖生長，提高菌體濃度；第二步在氮源限制條件下促使可德膠的合成［9]。研究人員還發現控制pH［10]，攪拌速率影響的氧溶解速率［11]，添加尿嘧啶［12]，使用多聚磷酸鹽［13]等對可德膠合成有顯著影響。本研究總結前人的研究結果，結合ATCC31749的基因組信息及蛋白組分析數據試圖闡述可德膠生物合成途徑及調控機理，并據此探討可德膠發酵工藝優化和發酵菌株改良的可能途徑。

1 基于土壤桿菌ATCC31749基因組信息對可德膠合成途徑的分析

目前多個農桿菌菌株（包含ATCC31749）的基因組的測序已基本完成。2001年根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciensstr.）C58序列信息和相關注釋的發表為土壤桿菌ATCC31749的基因信息研究提供了重要參考［14]。2011年，土壤桿菌ATCC31749基因組信息正式發表［15]，經blast分析，土壤桿菌ATCC31749與根癌農桿菌C58序列相似度達到95%。在可德膠合成途徑的研究方面，Stasinopoulos等［16]通過轉座子插入失活及功能互補分析，在土壤桿菌ATCC31749的基因組中定位了2個可德膠合成的基因座位，其中位置I是可德膠合成操縱子，含有crdA、crdS和crdC3個基因，位置II編碼一個潛在調控可德膠合成的蛋白crdR；2003年，Karnezis等［17]研究確定了crdS基因編碼可德膠合成酶的催化亞基，是可德膠合成的關鍵基因，利用crdS蛋白及纖維素合成酶作內參進行同源聚類分析，作出了Fulvimarina pelagiHTCC2506，Agrobacteriumsp. ATCC31749，Agrobacterium tumefaciens（strain C58/ATCC33970），Rhizobium leguminosarumbv.viciae USDA 2370，Agrobacterium tumefaciens5A，Agrobacteriumsp.（strain H13-3）的系統發育樹，顯示可德膠合成酶在土壤菌屬關系較近，且與C58菌株具100%的同源性（圖1）。

可德膠的合成需要低氮、低pH的環境因素誘導，也需要三羧酸（TCA）循環提供物質和能量，在可德膠合成期，TCA下游代謝受到抑制，脂多糖和脂蛋白合成減少，而UDPG與UDP之間轉化增強，并消耗大量ATP，需要大量O2參與電子傳遞鏈來提供能量［18]。通過序列blast比對和蛋白組學分析，在C58中證實功能的關鍵基因可在ATCC31749中定位，如表1所示。表1中所示前兩部分基因為ATCC31749可德膠代謝基本途徑各酶的對應基因，其中第一部分基因編碼逆境條件下催化可德膠合成各步驟的酶或因子，在可德膠合成期，其蛋白表達上調；第二部分基因編碼正常條件下糖類、脂類、蛋白質循環代謝的各酶，在可德膠合成期，其蛋白表達下降［10]；第三部分為可德膠合成的調控基因；第四部分為電子傳遞鏈中的關鍵基因。目前表中所示的基因已在ATCC31749中找到精確的核酸和蛋白序列［19]，ATP等能量供應是影響可德膠產量的關鍵因素，其電子傳遞鏈能量代謝情況值得深入研究。ATCC31749與C58的基因組相似度極高（表1），而目前C58尚未有可德膠合成的報道，其原因或是C58缺少低氮等逆境條件下的誘導，或是其合成與運輸基因調控網絡中關鍵元件的缺失等，尚需進一步研究。

2 可德膠合成信號轉導及其調控途徑分析

2.1 氮信號轉導途徑

細菌的氮素調控經典途徑是NtrB-NtrC雙組件調控系統，菌體可通過胞內信號分子α-酮戊二酸（2OG）和谷氨酰胺（Gln）含量的比值變化來感知外界環境中氮源的豐缺程度。當胞內2OG 含量充足時，表明外界環境中氮源受到限制，組氨酸激酶 NtrB 催化應答調控蛋白 NtrC磷酸化，使 NtrC 處于活化狀態，從而激活相關啟動子和基因的轉錄，提高氮源利用相關酶的表達量，并且影響可德膠和其他多糖的合成，同時谷氨酰胺合成酶（GS）在腺苷轉移酶（ATase）的作用下脫酰苷而處于活化狀態，催化谷氨酸合成谷氨酸酰胺，進而在谷氨酸合成酶的作用下，催化α-酮戊二酸（2OG）與谷氨酰胺合成2分子谷氨酸，并盡可能有效地從外界吸收氮源，形成銨態氮后，轉化為有機氮（主要是氨基酸和核苷酸）而快速適應氮源限制環境；相反，當胞內 Gln 含量充足時，表明外界環境氮源充足，NtrB調節磷酸酶活性使 NtrC 脫磷酸化而處于失活狀態，關閉氮源代謝相關酶編碼基因的轉錄和表達，此時菌體中GS被酰苷化而失活［20]。ATCC31749中NtrB-NtrC系統對氮源的反應已在基因和蛋白質水平得到了驗證，由蛋白雙向電泳結果表明有40種蛋白在NtrC突變體中不能表達，但是葡萄糖磷酸變位酶的活性在NtrC突變株中活性持續增長，在此條件下，此酶應是維持菌株正常生長的代償性增長；對于NtrB 突變體，在氮源限制時NtrC應急反應不能進行［21]。Kim等［22]發現創傷弧菌（Vibrio vulnificus）胞外多糖的合成（包括CPS和EPS），受低氮條件下誘導，并受轉錄因子NtrC與σ因子（rpoN或其他）的調控，但Ruffing 等［23]

發現，RpoN（σ因子）敲出體中可德膠合成的增加30%，預示磷酸化的ntrC可能直接作為可德膠合成相關基因的活化轉錄因子，而RpoN的突變降低了RpoN對活性NtrC競爭結合，增強了可德膠合成代謝途徑基因的轉錄活化。

表1 可德膠合成相關基因在土壤桿菌ATCC31749中定位情況

2.2 第二信使C-di-GMP對可德膠合成的作用

環二鳥甘酸（c-di-GMP）是1987年在研究木醋桿菌（Acetobacter xylinum）中纖維素合成調控的過程發現的，這種低分子量、高穩定的核苷酸信號分子使木醋桿菌纖維素產量提高200倍［24]。進一步研究表明，c-di-GMP是一種普遍存在的調控革蘭氏陰性細菌生物膜合成的第二信使，通常含有GGDEF保守結構的合成酶（DGC）和含有EAL或HD-GYP保守結構蛋白的降解酶（腺苷二磷酸酶）來控制其在細胞內的合成和分解［25]。ATCC31749基因組含有31個含有GGDEF保守結構域的潛在鳥苷酸環化酶（DGC）和十幾個含EAL或HD-GYP保守結構域的磷酸二脂酶（PDE）基因，表明ATCC31749菌株含有正常的c-di-GMP及信號傳導系統。Ruffing等通過轉錄組分析發現，在限制氮源的培養條件下，有3個GGDEF保守結構域的基因表達增高2倍以上，將這3個基因敲出后，其中一個基因（AGRO_3967）的敲出，相比對照，可德膠合成降低了1倍。我在ATCC31749菌株中表達來源于大腸桿菌，能合成c-di-GMP的鳥苷酸環化酶（DGC）yddV基因和降解c-di-GMP磷酸二脂酶（PDE）yhjH，結果發現yddV和yhjH的表達改變了ATCC31749菌株中c-di-GMP的含量；在對pBQyddV/ATCC31749，pBQyhjH/ATCC31749，pBQ/ATCC31749（對照）3菌株進行可德膠的發酵培養發現，經120 h的發酵培養后pBQyddV/ATCC31749可德膠含量最高，pBQyhjH/ATCC31749幾乎檢測不到可德膠的合成，而對照pBQ/ATCC31749的含量低于pBQyddV/ATCC31749菌株（未發表數據），而初步揭示了在ATCC31749中可德膠的合成是受第二信使環鳥苷二磷酸（c-di-GMP）正調控。

C-di-GMP通過與效應蛋白受體（如fleQ，pelD，vpsR和vpsT）或被調控基因的非編碼的特異序列形成的特殊二級結構（如核糖核酸分子開關，riboswtich）相接合而誘發基因轉錄、蛋白質翻譯及翻譯后修飾的信號網絡傳導過程，最終誘發與細菌運動、致病性、生物膜（包括胞外多糖）合成相關的生理代謝變化［26-28]。利用ATCC31749基因組信息進行blast分析：pelD未發現同源基因；FleQ，vpsR均與ATCC31749中低氮信號感應與傳遞的轉錄因子NtrC具55%的同源性；而VpsT則與其群體效應（quorum sensing）的轉錄因子LuxR 基因高度同源。Nesper等［29]報道了一個人工合成能從蛋白組中捕獲c-di-GMP結合蛋白的分子（cdG-CC），該分子具有3個功能基團，用其進行c-di-GMP結合蛋白的分離及質譜測定是目前研究ATCC41749中c-di-GMP調控可德膠合成信號傳遞，特別是c-di-GMP受體分子的有效手段之一。

2.3 多聚磷酸鹽、酸鈣復合體、嚴緊反應相關的信號途徑

能量的供應是可德膠合成的重要限制因子，一種潛在的能量源就是包括多個高能磷酸鍵的多聚磷酸鹽［30]，在細胞內多聚磷酸鹽在酸鈣復合體中積累，其水平受到胞外多磷酸酯酶（PPX）活性的影響。多聚磷酸鹽除了作為一種高能鍵的儲備物外，它的積累也是一種嚴緊應答反應。細胞內作嚴緊反應信號，鳥苷五磷酸鹽（pppGpp）和鳥苷四磷酸鹽（ppGpp）［簡稱（p）ppGpp] 的積累能抑制胞外多磷酸酯酶活性外，還能直接影響許多基因的轉錄和翻譯［31]。嚴緊反應信號（p）ppGpp的合成受氨基酸饑餓的誘導，在限制氮素時，氨基酸合成降低或停滯，而導致酮酸的積累進而降低胞內的pH值，pH為5.5時是可德膠合成的最佳條件，比其正常生長的pH（7.0）要低很多。在此過程中rrpP基因（編碼一種膜相關的質子變位焦磷酸酶）可控制質子在胞液和酸鈣復合體間的轉運從而調節pH，它在可德膠合成期比菌體生長期表達下調了7倍；在可德膠合成過程中，轉錄組分析及敲出試驗表明嚴緊控制信號基因relA/spoT系統決定著能否產生可德膠，而不僅僅是只調控其產量高低［23]。研究還發現，在該菌的培養基中加入三羧酸循環的代謝中間物（如檸檬酸，蘋果酸等）可刺激多糖合成［32]，這與我們的前期研究在低氮、低pH條件的培養基中加入檸檬酸能增強野生型ATCC31749可德膠的產率（結果未發表）相符合。檸檬酸在此反應中除作為三羧酸循環的重要中間產物，還起到調節環境pH等作用。因此多聚磷酸鹽積累、酸鈣復合體形成導致的pH變化及細胞嚴緊反應因子的變化等相互交織，決定著可德膠的合成及產量。

2.4 crdR的調控作用

crdR是可德膠合成的潛在調控基因［16]，目前其對可德膠合成的調控機理的研究還較少，試驗表明crdR的敲除使ATCC31749菌株喪失了可德膠多糖的合成能力［33]。我們在ATCC31749中表達crdR，相對于對照，可德膠合成增加35%，半定量PCR初步分析發現crdR表達后，無論在細胞增殖期還是在可德膠的合成期，ATCC31749菌株crdS均呈上調表達的趨勢（未發表數據）。克隆后測序分析發現，crdR與苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti，Strain 1021）轉錄因子 phrR 高度同源，并且苜蓿中華根瘤菌中轉錄因子phrR的表達在pH<6.2的條件下增強了5倍［34]，類比預示ATCC31749菌株中，酸性條件刺激可德膠的合成可能受控于crdR的表達，目前推測crdR與pH降低所引起的信號感應與轉導有很大關系。我們對可德膠多糖生物合成代謝網絡的關鍵基因編碼的蛋白crdA，crdS，crdC和crdR中均存在一些潛在的c-di-GMP結合的位點，推測c-di-GMP在ATCC31749菌株中，可能在轉錄水平上首先與crdR等轉錄因子相結合而誘導了包括crdA，crdS和crdC等合成相關基因的表達，且c-di-GMP進一步與crdA，crdS和crdC相結合，激活關鍵合成酶系統，但具體的調控可德膠的合成機制有待進一步的闡述。

3 展望

綜合以上分析，就可徳膠發酵合成的整個代謝過程而言，氮源限制、酸性環境、溶氧量及攪拌速度等都密切影響著可徳膠的合成。根據測序的土壤桿菌ATCC31749基因組信息初步確定了可徳膠的合成途徑和主要的調控基因及調控機理，但其信號轉導網絡有待更多的研究和相關試驗的證實。文獻中有一些有趣的問題引起了我們的注意：在可徳膠合成過程中，能量比底物的限制更具影響力，研究者對發酵過程中UTP、ATP、ADP、AMP、NAD+、NADH和UDPG等進行監測發現，即使UDPG的量很高，但ATP水平不高時可徳膠合成仍然很有限［10]，蛋白組學結果表明在可徳膠合成量高時，ATP合成酶和UTP合成酶表達都有較大增長［23]。雖然現在公認的可徳膠合成是以UDPG為單糖載體，但ATP在其中所起的作用是不可否認的，ATP可作為能量物質也可能是單糖的結合載體。在可徳膠合成后轉運途徑中，PssAG可能參與了運輸過程［35]，但可德膠從胞內運輸到胞外的通道結構和調控機制也是將來研究的熱點。

為了提高大規模發酵生產中可德膠的效率，菌株選育與優化是關鍵，雖然傳統的誘變選育方法獲得良好的效果，但在基因組信息已知的前提下，代謝工程手段改造是獲得高產菌株是另一條重要途徑。提高熱凝膠合成過程中葡萄糖轉化為可德膠的代謝流，增強菌體細胞呼吸鏈的整體效率以增強ATP的生成能力，并結合普通的誘變與適應馴化應該是未來菌株優化的首選方法。如通過表達Vhb基因增強在可德膠合成過程中細胞內的氧分壓［36]，表達c-di-GMP合成酶基因（如AGRO_3967）增加胞內c-di-GMP含量，表達pH調控相關的蛋白crdR等（見前述）；通過ATCC31749基因組信息敲除如rpoN、部分c-di-GMP降解酶、多聚磷酸水解酶ppX1等基因將是未來代謝工程改造和優化菌株的首選方法；增強該菌株廉價碳源利用如纖維素、半纖維素利用能力的酶類的表達，從而降低發酵成本；并且從工藝上改進發酵設備，優化規模，提高分離純化水平等解決可德膠生產過程的限制因子，提高可德膠的產量和質量。

［1] Harada T, Masada M, Fujimori K, et al. Production of a firm resilient gel-forming polysaccharide by a mutant ofAlcaligenes faecalisvar.myxogenes 10C3［J] . Agric Biol Chem, 1966, 30：196-198.

［2] Zhang HB, Nishinari K, Williams MAK, et al. A molecular description of the gelation mechanism of curdlan［J] . Int J Biol Macromol, 2002, 30：7-16.

［3] Laroche1 C, Michaud P. New developments and prospective applications for β（1, 3）glucans［J] . Recent Pat Biotechnol, 2007, 1（1）：59-73.

［4] Goodridge HS, Wolf AJ, Underhill DM. β-glucan recognition by the innate immune system［J] . Immunol Rev, 2009, 230：38-50.

［5] Lehtovaara BC, Gu FX. Pharmacological, structural, and drug delivery properties and applications of 1, 3-β-glucans［J] . Agric Food Chen, 2011, 59（13）：6813-6828.

［6] Karnezis T, Epa VC, Stone BA, et al. Topological characterization of an inner membrane（1→3）-β-D-glucan（curdlan）synthase fromAgrobacteriumsp. strain ATCC31749［J] . Glycobiology,2003, 13（10）：693-706.

［7] Kim MK, Lee IY, Lee JH, et al. Residual phosphate concentration under nitrogen-limiting conditions regulates curdlan production inAgrobacteriumspecies［J] . J Ind Microbiol Biotechnol, 2000, 25：180-183.

［8] Yu LJ, Wu JR. Changes of curdlan biosynthesis and nitrogenous compounds utilization characterized in ntrC mutant ofAgrobacteriumsp. ATCC 31749［J] . Curr Microbiol, 2011, 63：60-67.

［9] 吳劍榮, 詹曉北, 劉惠, 等. 氨水流加用于糞產堿桿菌熱凝膠發酵［J] . 生物工程學報, 2008, 24（6）：1035-1039.

［10] Jin LH, Um HJ, Yin CJ, et al. Proteomic analysis of curdlanproducingAgrobacteriumsp. in response to pH downshift［J] .Biotechnol, 2008, 138（3-4）：80-87.

［11] Zhang HT, Zhan XB, Zheng ZY. Improved curdlan fermentation process based on optimization of dissolved oxygen combined with pH control and metabolic characterization ofAgrobacteriumsp.ATCC 31749［J] . Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93：367-379.

［12] Lee JH, Lee IY. Optimization of uracil addition for curdlan（β-1→3-glucan）production byAgrobacteriumsp.［J] . Biotechnol Lett,2001, 23：1131-1134.

［13] Yu LJ, Wu JR Liu J, et al. Enhanced curdlan production inAgrobacteriumsp. ATCC 31749 by addition of low-polyphosphates［J] .Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2011, 16：34-41.

［14] Goodner B, Hinkle G, Gattung S. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agentAgrobacteriumtumefaciensC58［J] . Journal Science, 2001, 294（5550）：2323-2328.

［15] Ruffing AM, Castro-Melchor M, Hu WS, et al. Genome sequence of the curdlan-producingAgrobacteriumsp. strain ATCC 31749［J] .Bacteriol, 2011, 193（16）：4294-4295.

［16] Stasinopoulos SJ, Fisher PR, Stone BA, et al. Detection of two loci involved in（1→3）-beta-glucan（curdlan）biosynthesis by ATCC31749, and comparative sequence analysis of the putative curdlan synthase gene［J] . Glycobiology, 1999, 9（1）：31-41.

［17] Karnezis T, Epa VC, Stone BA, et al. Topological characterization of an inner membrane（1→3）-beta-D-glucan（curdlan）synthase fromAgrobacteriumsp. strain ATCC31749［J] . Glycobiology,2003, 13（10）：693-706.

［18] Zhan XB, Lin CC, Zhang HT, et al.Recent advances in curdlan biosynthesis, biotechnological production, and applications［J] .Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93（2）：525-531.

［19] Zhang HT, Setubal JC, Zhan XB, et al. Component identification of electron transport chains in curdlan-producingAgrobacteriumsp.ATCC 31749 and its genome-specific prediction using comparative genome and phylogenetic trees analysis［J] . Ind Microbiol Biotechnol, 2011, 38：667-677.

［20] Dodsworth JA, Leigh JA. Nitrogen regulation in bacteria and archaea［J] . Annu.Rev Biochem, 2007, 61：349-377.

［21] Wu JR. NtrC-dependent regulatory network for curdlan biosynthesis in response to nitrogen limitation inAgrobacteriumsp. ATCC 31749［J] . Process Biochemistry, 2011, 9410：7-13.

［22] Kim HS, Lee MA, Chun SJ. Role of NtrC in biofilm formation via controlling expression of the gene encoding an ADP-glyceromanno-heptose-6-epimerase in the pathogenic bacterium,Vibrio vulnificus［J] . Mol Microbiol, 2007, 63（2）：559-574.

［23] Ruffing AM, Chen RR. Transcriptome profiling of a curdlanproducingAgrobacteriumreveals conserved regulatory mechanisms of exopolysaccharide biosynthesis［J] . Microbial Cell Factories,2012, 11（1）：1-13.

［24] Ross P, Weinhouse H, Aloni Y, et al.Regulation of cellulose synthesis inAcetobacter xylinumby cyclic diguanylic acid［J] .Nature, 1987, 325（6101）：279-281.

［25] Schirmer T, Jenal U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signaling［J] . Nat Rev Microbiol, 2009, 7（10）：724-735.

［26] Hickman JW, Harwood CS. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor［J] .Mol Microbiol, 2008, 69（2）：376-89.

［27] Kulshina N, Baird NJ, Ferré-D’Amaré AR. Recognition of the bacterial second messenger cyclic diguanylate by its cognate riboswitch［J] . Nat Struct Mol Biol, 2009, 16（12）：1212-1217.

［28] Krasteva PV, Fong JC, Shikuma NJ, et al.Vibrio choleraeVpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP［J] . Science, 2010, 327（5967）：866-868.

［29] Nesper J, Reinders A, Glatter T, et al. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins［J] . Proteomics, 2012, 75（15）：4874-4878.

［30] Zheng ZY, Lee J, Zhan X, et al.Effect of metabolic structures and energy requirements on curdlan production byAlcaligenes faecalis［J] . Biotechnol Bioprocess Eng, 2007, 12：359-365.

［31] Vercruysse M, Fauvart M, Jans A, et al. Stress response regulators identified through genome-wide transcriptome analysis of the（p）ppGpp-dependent response inRhizobium etli［J] . Genome Biol,2011, 12（2）：1-19.

［32] Ruffing AM, Chen RR. Citrate stimulates oligosaccharide synthesis in metabolically engineeredAgrobacteriumsp.［J] . Appl Biochem Biotechnol, 2011, 164（6）：851-866.

［33] Bacis A, Fincher GB, Stone BA. Chemistry, biochemistry, and biology of（1-3）-β-glucans and related polysaccharides［M] .USA：Academic Press is an Imprint of Elsevler, 2009：1-209.

［34] Reeve WG, Tiwari RP, Wong CM, et al. The transcriptionalregulator gene phrR in Sinorhizobium meliloti WSM419 is regulated by low pH and other stresses［J] . Microbiology, 1998, 144：3335-3342.

［35] Karnezis T, Fisher HC, Neumann GM, et al. Cloning and characterization of the phosphatidylserine synthase gene ofAgrobacteriumsp. strain ATCC 31749 and effect of its inactivation on production of high-molecular-mass（1→3）-β-D-glucan（curdlan）［J] . J Bacteriology, 2002, 184（15）：4114-4123.

［36] Stark BC, Dikshit KL, Pagilla KR. Recent advances in understanding the structure, function, and biotechnological usefulness of the hemoglobin from the bacteriumVitreoscilla［J] . Biotechnol Lett,2011, 33（9）：1705-1714.