5-氮胞苷聯(lián)合丹酚酸B促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化*

高 青，季 紅，胡先同，王一婧，范英昌

骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）是從中胚層發(fā)育的早期細胞，具有自我更新和多向分化潛能，可分化為脂肪細胞、成骨細胞、心肌細胞[1]。在組織工程中，MSCs作為一種重要的種子細胞越來越引起人們的關注。其中MSCs分化為心肌細胞給心肌梗死的治療帶來了新的希望，目前臨床上將MSCs直接注射到心肌梗死區(qū)域雖然在一定程度上可改善心臟的功能但也有很多不良反應，如心律不齊等，因此在移植前對MSCs進行預處理是很有必要的。經(jīng)典的誘導MSCs分化為心肌細胞的藥物5-氮胞苷為一種去甲基化藥，對細胞有一定的毒性作用，不適合應用于臨床[2-3]。本研究將5-氮胞苷聯(lián)合有保護心肌細胞作用的丹酚酸B應用于MSCs向心肌細胞分化的過程中，為臨床應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 體質(zhì)量為（200±20）g的清潔級SD雄性大鼠（中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物中心，動物許可證號：scxk2009-0001）。

L-DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；特級胎牛血清（FBS，美國GIBCO公司）；CD44兔多克隆抗體，CD34兔多克隆抗體，即用型SABC免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒AR1025，均由武漢博士德生物工程有限公司提供；實時熒光定量PCR（QPCR）試劑盒及Western blot試劑盒（北京康為試劑）；心肌早期轉(zhuǎn)錄因子（GATA-4）及心肌特異性肌凝蛋白重鏈（α-MHC）兔單克隆抗體（美國EPITMICS公司）；所用引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 MSCs體外分離、培養(yǎng)方法 大鼠MSCs體外分離和培養(yǎng)采用貼壁培養(yǎng)法：取雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死，無菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，適量D-Hank’s液沖洗骨髓，100目篩網(wǎng)過濾，然后離心（800r/min，5min），接種于完全培養(yǎng)液（L-DMEM 含體積分數(shù)為10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素），置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每3 d更換1次培養(yǎng)液。1周后,細胞80%長滿瓶底。

1.3 MSCs的鑒定 選用生長狀況良好的第3代（P3）MSCs，用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）法檢測細胞表面抗原CD44和CD34。

將大鼠MSCs培養(yǎng)于6孔板，孔板內(nèi)置無菌蓋玻片，1周后，細胞80%長滿瓶底，用95%乙醇（加少量冰醋酸）固定15 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3遍，每遍5min。用3%的H2O2溶液室溫浸泡30min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。再次PBS清洗，后滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫孵育20 min，甩去多余液體。滴加1∶100一抗（兔IgG）4℃過夜。PBS清洗3遍，每遍5 min，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育20 min。PBS清洗3遍，每遍5 min，滴加試劑SABC，37℃孵育20 min。PBS清洗3遍，每遍5 min。DAB室溫顯色，鏡下控制反應時間，一般在5～30 min之間。蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。

1.4 MSCs的誘導及繼續(xù)培養(yǎng) 將生長良好的第4代細胞分為4個組：正常對照組、5-氮胞苷組、丹酚酸B組、5-氮胞苷+丹酚酸B組。5-氮胞苷濃度為10 μmol/L，丹酚酸B濃度為22 μmol/L。加藥前1 d各組細胞加不含血清的培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)，加藥24 h后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，之后隔天換液培養(yǎng)2周。

1.5 誘導后MSCs的QPCR檢測 采用DNA/RNA/蛋白分離試劑盒從MSCs中提取總RNA；反轉(zhuǎn)錄制備cDNA；以cDNA為模版，在反應體系中加入目的基因和內(nèi)參對照基因的引物，見表1，按照QPCR說明書加入試劑及設定條件，進行目的基因的擴增。

表1 QPCR的引物

1.6 Western blot檢測蛋白表達 采用細胞漿及細胞核蛋白提取試劑盒從貼壁細胞中獲取總蛋白，細胞裂解液均一化后用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，加上樣緩沖液煮沸5 min。SDS-PAGE電泳：按《分子克隆》方法進行SDS-PAGE，積層膠5%，分離膠6%、12%，膠厚1 mm、0.75 mm。濕法轉(zhuǎn)膜：膠于轉(zhuǎn)移液（含甲醇15%）中平衡10 min；從下至上分別放置濾紙、膠、PVDF 膜（0.45 μm）、濾紙，夾子夾好放入倒好轉(zhuǎn)移液的轉(zhuǎn)移槽中，250 mA轉(zhuǎn)膜90 min。封閉：將膜取出，放入含5%脫脂奶粉的抗體稀釋液（PBST），室溫封閉2 h。一抗、二抗結(jié)合：取出膜，對應一抗 1∶200稀釋，4℃過夜；PBST洗3次，每次10 min；二抗1∶10 000稀釋，室溫結(jié)合1 h；分別用PBST和PBS各洗3次，每次10 min。顯影：等比例混合顯色基質(zhì)A液和B液，均勻滴加膜上，靜置1 min，用保鮮膜將膜包好，輕輕擠出多余顯色基質(zhì)，放入暗盒，曝光 2～5min。

1.7 統(tǒng)計分析 應用SPSS 18.5統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs形態(tài)學觀察 MSCs于接種4 h后即見細胞貼壁，24 h后可見貼壁的MSCs呈紡錘狀的成纖維細胞樣外觀。原代培養(yǎng)3 d后，細胞開始呈集落樣生長，增殖明顯，細胞呈梭形或星形，體積較小，隨著繼續(xù)培養(yǎng)，細胞體積增大，約14 d后可鋪滿瓶底。

2.2 MSCs表面抗原的免疫細胞化學染色結(jié)果 MSCs免疫細胞化學染色結(jié)果顯示CD44呈陽性表達，CD34呈陰性表達。陽性細胞胞漿內(nèi)含棕黃色、顆粒狀物質(zhì)，見圖1、圖2。

圖1 MSCs CD44表達陽性

圖2 MSCs CD34表達陰性

2.3 QPCR及Westernblot檢測結(jié)果 加藥誘導2周后，檢測各組中GATA-4、α-MHC的mRNA及蛋白的表達量。結(jié)果顯示，5-氮胞苷組、丹酚酸B組、5-氮胞苷+丹酚酸B組GATA-4、α-MHC mRNA及蛋白的表達量高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。5-氮胞苷+丹酚酸B組的GATA-4、α-MHC mRNA及蛋白的表達量高于5-氮胞苷組、丹酚酸B組，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖3-5，表2、表3。

表2 誘導2周后GATA-4和α-MHC mRNA的表達量

表3 蛋白條帶灰度分析

圖3 誘導2周后GATA-4和α-MHC mRNA的表達量

圖4 誘導2周后GATA-4和α-MHC蛋白的表達量

圖5 蛋白條帶灰度分析

3 討論

本研究將5-氮胞苷聯(lián)合丹酚酸B作用于MSCs以檢測其分化為心肌樣細胞的能力。結(jié)果顯示5-氮胞苷與丹酚酸B聯(lián)合作用可成功誘導MSCs向心肌樣細胞分化，GATA-4、α-MHC mRNA及蛋白的表達含量為正常對照組的4倍左右。且兩種藥物聯(lián)合使用作用強于任何一種單一的藥物，聯(lián)合用藥組中GATA-4、α-MHC mRNA及蛋白的表達含量是單獨用藥組的兩倍左右。5-氮胞苷和丹酚酸B兩組之間沒有明顯差異。

MSCs保持著很強的分化潛能，多年來研究者嘗試各種方式促進其分化為心肌細胞，但效果不甚理想[4]。經(jīng)典的5-氮胞苷是目前使用比較多的促心肌分化藥物，有一定的效果，但會對細胞產(chǎn)生毒性作用[3]。丹酚酸B是丹參的一種單體，臨床上有活血化瘀的作用，用于心血管系統(tǒng)疾病的治療[5-6]。近年來，從基因水平上重塑MSCs的特征成為最新的干細胞研究熱點。Islet-1基因是LIM轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，在乙酰化調(diào)控間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用[7-9]。研究表明miR-1、206、24、181及新發(fā)現(xiàn)的 miR-499等 miRs具有誘導MSC向心肌細胞分化的功能，同時miR-133向?qū)π募〖毎只^程具有抑制作用[10-12]。此外，信號通路的開關也直接影響到MSCs向心肌細胞分化的過程。抑制經(jīng)典Wnt信號通路促進MSCs向心肌細胞的分化過程[13-14]，而激活Notch信號通路同樣可促進此過程。Notch信號主要通過臨近細胞間的相互作用來精確調(diào)控各譜系細胞的增殖與分化[15]。

綜上所述，本實驗證明了5-氮胞苷和丹酚酸B聯(lián)合作用可提高MSCs向心肌細胞分化的程度，為臨床應用提高一定的理論基礎。同時，MSCs分化為心肌細胞是一個十分復雜的過程，還需要從多方面多角度的思考這個問題，進行深入的研究，闡明其分化的關鍵點以為臨床上的應用打下基礎。

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