BMSC“s歸巢”在AMI后心肌重塑中的作用及活血化瘀藥的干預研究*

趙海濱，張秀靜，王 帥，郭 夢，馬 迪，許曉英

急性心肌梗死（AMI）后的心肌重塑與心臟破裂、室壁瘤形成及心力衰竭等嚴重并發癥密切相關，在AMI病死率及預后中起至關重要的作用[1]。AMI后心肌重塑機制復雜，后果嚴重，療效不理想，相關研究亟待深入。目前研究證實[2]，在AMI時自體骨髓間充質干細胞（BMSCs）可自發地向損傷心肌歸巢，并在梗死部位特定的微環境誘導作用下，分化成新的心肌細胞，達到修復和再生心肌的目的，且能與宿主細胞在結構和功能上進行整合，實現“無創性”組織再生，抑制/減緩心肌重塑的發生。但目前對其歸巢缺乏有效的動員手段。活血化瘀中藥以中醫“祛瘀血、生新血”為理論基礎，對AMI后心肌重塑療效肯定，本課題組通過研究祛瘀生新法在大鼠急性心梗后心肌重塑中的干預作用及對BMSCs“歸巢”動員的影響，探討祛瘀生新法對急性心梗后心肌重塑的效應機制，為活血化瘀藥治療急性心梗后心肌重塑提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 成年清潔級Wistar大鼠80只，體質量（250±10）g，由北京中醫藥大學東直門醫院動物實驗中心提供（合格證號0240574）；試劑用藥血塞通軟膠囊由昆明圣火制藥有限責任公司提供（批號Z19990022），基質細胞衍生因子-1受體阻斷劑（AMD3100）由北京啟維益成科技有限公司提供（批號239820-5MG），熒光素藻紅蛋白（PE）標記的骨髓基質干細胞抗原1抗體及心肌c-kit抗體均由北京博奧森生物科技有限公司提供；多媒體生物信號記錄分析系統MS2000型（廣州市龍飛科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作 用隨機數字表法將大鼠分為正常組、假手術組、模型組、中藥組、西藥組，每組16只，分籠飼養。

模型組：參照文獻[3－4]制備AMI大鼠模型。鹽酸戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉。經口氣管插管行小動物呼吸機輔助呼吸，有氧正壓通氣，潮氣量 5～6 mL，呼吸比 1∶2，呼吸頻率 80 次/min。連接標準12導聯，記錄大鼠心電圖。經左前胸廓旁第3、4肋間逐層開胸，暴露心臟，分離心包，在肺動脈圓錐和左心耳交界處用5-0號絲線結扎左冠狀動脈前降支（LAD）近端制成心肌梗死模型，以心電圖出現壞死性Q波判斷為可能心肌梗死，若無病理性Q波，則再次結扎，以提高心肌梗死模型成功率，然后逐層縫合心腔。術后常規抗感染治療。

中藥組：制備AMI大鼠模型，術后立即灌胃給藥，給藥量按《藥理實驗方法學》所示劑量換算法計算[5]：200g大鼠劑量（g/kg）=成人的劑量[1g/（kg·d）×0.018]。每日灌胃 1 次，共用 7 d。

西藥組：制備AMI大鼠模型,第6天腹腔注射AMD3100（5 mg/kg），余同模型組大鼠。

假手術組：大鼠經歷上述手術過程，絲線從冠狀動脈下穿過但不結扎。

正常組：不做造模處理。

1.2.2 病理形態學檢查 于上述各組處死大鼠，取心肌組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片蘇木-伊紅（H-E）染色。常規H-E染色在光鏡下進行病理觀察。

1.2.3 心肌梗死面積硝基四氮唑藍（N-BT）染色 參照Shatney等[6]的N-BT組化染色方法造模1周后，處死動物，取出心臟，以結扎線為標志，每隔3 mm取心臟橫斷面，每只大鼠心臟取材3塊，生理鹽水沖洗，N-BT染色后，微距照相，像片輸入圖像處理系統，每只大鼠心臟取5個橫斷面，分別記錄梗死區占心臟橫截面的面積百分比，取其平均值。

1.2.4 流式細胞儀檢測 大鼠麻醉后，腹主動脈采血，肝素抗凝。Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，稀釋至1×106個/mL，分別加入PE標記的c-kit受體單克隆抗體，流式細胞儀檢測。

1.2.5 免疫組化檢測 采用S-P法，DAB顯色，在400倍顯微鏡下計數單位面積內陽性細胞數量，每張切片隨機取9個視野，取其均值作為測定值，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.6 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計量資料組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌組織病理學觀察 H-E染色結果顯示：正常組及假手術組整體均呈現正常心肌膜組織（見圖1A、圖1B）。模型組：心肌細胞數量較少且散在，結締組織整片廣布，炎性細胞聚集，成纖維細胞多，整體呈現心肌梗死（重癥）心肌膜組織（見圖1C）。中藥組：心肌細胞間有大量炎性細胞聚集，整體呈現心肌炎心肌膜組織（見圖1D）。西藥組：結締組織整片占據切片較大區域，炎性細胞散在，淺粉紅色膠原成分較多，紅細胞聚集且多，整體呈現心肌梗死（輕癥）心肌膜組織（見圖1E）。

2.2 各組大鼠心肌梗死面積檢測結果 模型組、中藥組、西藥組均高于假手術組（P<0.01），中藥組與西藥組均低于模型組（P<0.05），中藥組與西藥組無明顯差異（P>0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積檢測結果（±s）

表1 各組大鼠心肌梗死面積檢測結果（±s）

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與中藥組比較，△P>0.05。

組別 n 心肌梗死面積（%）假手術組 10 2.60±1.67模型組 10 21.18±2.29*中藥組 10 16.40±3.11*#西藥組 10 15.23±2.12*#△

2.3 流式細胞儀檢測結果 模型組、中藥組、西藥組均高于假手術組（P<0.01），中藥組與西藥組均高于模型組（P<0.05），中藥組與西藥組無明顯差異（P>0.05）。見表2。

表2 各組外周血PE標記CD117細胞數流式細胞儀檢測結果（±s）

表2 各組外周血PE標記CD117細胞數流式細胞儀檢測結果（±s）

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與中藥組比較，△P>0.05。

組別 n CD117細胞數假手術組 10 1.60±0.67*模型組 10 2.18±0.29*中藥組 10 3.40±0.11*#西藥組 10 4.23±0.12*#△

2.4 免疫組化檢測 見圖2。模型組、中藥組、西藥組均高于假手術組（P<0.01），中藥組與西藥組均高于模型組（P<0.05），中藥組與西藥組無明顯差異（P>0.05），見表3。

圖1 各組心肌組織病理圖像（H-E染色×200）

圖2 各組心肌組織免疫組化檢測圖像（×400）

表3 各組免疫組化c-kit標記細胞檢測結果（±s）

表3 各組免疫組化c-kit標記細胞檢測結果（±s）

注：與假手術組比較,*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05；與中藥組比較，△P>0.05。

組別 n c-kit標記細胞數假手術組 10 26.0±6.7模型組 10 168.0±7.5*中藥組 10 188.0±7.9*#西藥組 10 195.0±6.8*#△

2.5 非梗死區膠原蛋白測定 結果顯示：模型組與假手術組相比較，非梗死區膠原沉積明顯（P＜0.05），活血化瘀組與模型組相比較膠原沉積降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組非梗死區膠原蛋白測定結果（±s）

表4 各組非梗死區膠原蛋白測定結果（±s）

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05;與活血化瘀組比較，△P>0.05。

組別 n 膠原蛋白含量（%）假手術組 10 3.42±0.47模型組 10 6.03±0.54*活血化瘀組 10 5.10±0.36#AMD3100 組 10 5.06±0.27#△

3 討論

BMSCs是一種來源于骨髓的多能干細胞，BMSCs不僅可向多種組織細胞分化，表現出很強的可塑性，而且還存在廣泛遷移現象，即“干細胞循環”，指干細胞通過機體的調控不斷地由原組織位點向新的組織位點遷移，并不斷進行自我更新和分化的過程，在生理或病理情況下參與多種組織的更新和修復，維持機體組織形態完整性和功能穩定性[7]。最近研究表明[8－9]，BMSCs“歸巢”在AMI后心肌重塑保護效應中療效確切，因而也應是較佳的治療靶點，然而正常情況下外周血中干細胞含量很低，達不到修復壞死心肌所需的濃度。西醫學治療AMI后心肌重塑，主要使用粒細胞集落刺激因子、AMD3100、粒巨細胞集落刺激因子等作為心肌梗死后干細胞“歸巢”的有效動員劑。本實驗證實心梗后，外周血及梗死心肌區BMSCs明顯增多，可能和ADM3100對干細胞循環有動員效應。

心肌梗死屬中醫“胸痹、真心痛”的范籌，是血道閉塞，血脈不通，瘀血滯塞脈絡所致，以“血氣不至”、“血凝而不流”、“血瘀滯不行”等為主要病理機制，以胸悶胸痛、心悸氣短等為主要癥狀。“祛瘀生新”亦稱化舊生新、除舊生新，一方面通過祛瘀、化舊、或去腐等方法來祛除體內沉積的瘀血及其他陳舊性的病理產物，另一方面強調應用生新方法來生新血、生新絡、生新物，“祛瘀”與“生新”相輔相成，不可偏廢[10]，因此王清任推崇逐瘀活血[11]。范英昌等[12]證實活血化瘀丹參提取物能增加心肌梗死區的血供。本實驗通過活血化瘀藥對大鼠急性心梗后心肌重塑的作用干預后，藥物組較模型組膠原含量明顯降低（P＜0.05），心肌梗死面積也有所減輕，這可能與活血化瘀中藥祛瘀通絡有關，也證實了活血化瘀藥能減輕大鼠心肌梗死面積。流式細胞儀及免疫組化檢測發現，中藥組較模型組BMSCs均明顯增多，說明活血化瘀藥能改善大鼠心肌梗死區的BMSCs數量，也是“生新血”的具體體現。至于活血化瘀法對提高大鼠心肌梗死區BMSCs數量的活化調控機制，還有待進一步深入研究。

[1]Weir R A，Clements S，Steedman T.Plasma TIMP-4 predicts left ventricular remodeling after acute myocardial infarction[J].Card Fail，2011，17（6）：465-471.

[2]Chiu R C.Adult stem cell therapy for heart failure[J].Expert Opin Biol Ther,2003，3(2):215-225

[3]Ueda S，Yamagishi S，Matsui T，et al，Administration of pigment epithelium-derived factor inhibits left ventricular remodeling and improves cardiac function in rats with acute myocardial infarction[J].Am J Pathol，2011，178 （2）：591-598.

[4]侯春麗，張冬梅，侯學紅，等.大鼠急性心肌梗死模型制備及對心功能影響的實驗研究[J].寧夏醫科大學學報，2010，32（9）：967-970.

[5]徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學[M].第3版.北京：人民衛生出版社，2001：202-204.

[6]Shatney,YinKeYang,Kimber L,et al.Transplantation of embryonic stem cells improves cardiac function in postinfarcted rats[J].J Appl Physiol,2002,92:288-296.

[7]張海嘯，史載祥.轉化生長因子-β信號傳導通路與心肌纖維化[J].中日友好醫院學報，2007，21（2）：110-112.

[8]Martin-Rendon E,Brunskill S J,Hyde C J,et al.Autologous bone marrow stem cells to treat acute myocardial infarction:a systematic review[J].Eur Heart J,2008,29(15):1807-1818.

[9]Brunskill S J,Hyde C J,Doree C J,et al.Route of delivery and baseline left ventricular ejection fraction,key factors of bone-marrow-derived cell therapy for ischaemic heart disease[J].Eur J Heart Fail,2009,11(9):887-896.

[10]趙海濱，張秀靜.祛瘀生新——心肌梗死中醫藥干預的新思考[C].北京中醫藥協會心血管病專業委員會年會論文集，2011，63.

[11]田 虎，王素改.試論王清任活血化瘀法及其成就[J].天津中醫藥大學學報，2006，25（4）：4－5.

[12]范英昌，華聲瑜，郭茂娟，等.丹酚酸B干預骨髓間充質干細胞移植對AMI大鼠心梗區血管新生的影響[J].天津中醫藥大學學報，2007，26（3）：3－4.