新生脈散片的提取工藝研究*

劉建海，崔維利，陳 濤，孟 萌

300193 天津中醫藥大學第一附屬醫院（崔維利，陳 濤，孟 萌）

新生脈散片具有益氣、活血、利水的功效，臨床用于治療氣虛血瘀水停證。全方由刺五加、黃芪、黨參、丹參等9味中藥材組成，方中君藥刺五加，功能益氣健脾，補腎安神，主含紫丁香苷等成分；黃芪功能補氣固表，利尿托毒，主含黃芪甲苷等成分[1]。為保證藥物療效和有效成分的提取效果，實驗中參考有關文獻[2-9]，采用正交實驗法，以紫丁香苷含量和黃芪甲苷含量為考察指標進行綜合評價，優選新生脈散片的提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司，配備Waters ACQUITY PDA二極管陣列檢測器，四元溶劑管理器，自動進樣恒溫管理器，EmpowerⅢ色譜工作站）；Waters 600E HPLC高效液相色譜儀（美國Waters公司，配備Waters 2420蒸發光散射檢測器，Waters 600E四元高壓泵，Waters In-Line脫氣機，EmpowerⅡ色譜工作站）；AG135電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫療儀器廠）。

1.2 試藥 紫丁香苷對照品（批號111574-200603）、黃芪甲苷對照品（批號110781-200109），均購自中國藥品生物制品檢定所；方中藥材購自安徽亳州藥材公司，經鑒定均符合中國藥典2010年版一部要求；乙腈（色譜純，美國Dikma公司）；磷酸（色譜純，天津科密歐公司）；正丁醇（天津市化學試劑批發公司）；氨水（天津市化學試劑批發公司）；水為自制超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 正交實驗設計 根據文獻資料及預實驗結果，影響有效成分提取效果的主要因素為加水量（A）、提取時間（B）、提取次數（C）。實驗中對上述每個因素設計3個水平，采用L9（34）正交實驗表，對新生脈散片的提取工藝進行優選，因素水平見表1。

表1 因素與水平

2.2 考察指標及評分方法 采用紫丁香苷含量和黃芪甲苷含量為考察指標，各占50%加權計算綜合評分，對新生脈散片的提取工藝進行綜合評價。按下式計算綜合評分。綜合評分＝（紫丁香苷含量／最大紫丁香苷含量）×50%×100＋（黃芪甲苷含量／最大黃芪甲苷含量）×50%×100。

2.3 紫丁香苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEN C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-水-磷酸（5∶95∶0.4）；流速：0.2 mL/min；進樣量：1 μL；檢測波長：265 nm；柱溫：30℃。

2.3.2 標準曲線的繪制 精密稱取經五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h的紫丁香苷對照品10.00mg，加甲醇溶解并定容至50 mL，即得0.200g/L的對照品貯備溶液。分別精密量取對照品貯備溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加甲醇稀釋并定容至10 mL，分別精密吸取上述溶液及對照品儲備溶液各1μL，依次注入超高效液相色譜儀，按“2.3.1”項色譜條件測定，以峰面積值為縱坐標，對照品的濃度（g/L）為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：Y贊=1.43×107X－5.55×104，r＝0.999 8（n＝6）。結果表明，紫丁香苷在 0.020～0.200g/L濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取紫丁香苷對照品適量，加甲醇溶解并配制成0.080g/L的溶液，過0.22 μm的微孔濾膜，取續濾液作為對照品溶液。

2.3.4 供試品溶液的制備 取新生脈散片處方中各藥材共9份，按正交實驗表中的條件，分別加水回流提取，合并水提液，靜置，濾過，濃縮至每1 mL相當于1g原生藥材的流浸膏，精密量取10 mL，用水飽和的正丁醇提取4次，每次20mL，合并正丁醇液，精密量取正丁醇液40 mL備用，其余正丁醇液水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL，過0.22 μm的微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液。

2.3.5 陰性供試品溶液的制備 取處方中除刺五加外其余藥物按“2.3.4”項制備方法，制成刺五加陰性供試品溶液。

2.3.6 專屬性實驗 分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各1 μL，注入超高效液相色譜儀，按“2.3.1”項色譜條件測定，陰性供試品色譜中，在與紫丁香苷對照品峰相應的位置上無干擾峰，結果見圖1。

2.3.7 樣品含量測定 分別精密吸取“2.3.4”項下制備的供試品溶液各1 μL，依次注入超高效液相色譜儀，按“2.3.1”項色譜條件測定，計算紫丁香苷的含量。

2.4 黃芪甲苷的含量測定

2.4.1 色譜條件 Waters Sunfire TM C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流動相：乙腈-水（35∶65）；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；蒸發光散射檢測器參數：漂移管溫度為65℃，載氣壓力為35 kPa。

2.4.2 標準曲線的繪制 精密稱取黃芪甲苷對照品12.00 mg，加甲醇溶解并定容至50 mL，即得0.240g/L的對照品貯備溶液。分別精密量取對照品貯備溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加甲醇稀釋并定容至10 mL，分別精密吸取上述溶液及對照品儲備溶液各10 μL，依次注入高效液相色譜儀，按“2.4.1”項色譜條件測定，以峰面積的對數值為縱坐標，對照品濃度（mg/mL）的對數值為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：Y贊=1.23X+6.17，r=0.999 7（n＝6）。結果表明，黃芪甲苷在0.024～0.240g/L濃度范圍內，對照品濃度的對數值與峰面積的對數值呈良好的線性關系。

2.4.3 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解并配制成0.120g/L的溶液，過0.45 μm的微孔濾膜，取續濾液作為對照品溶液。

2.4.4 供試品溶液的制備 取“2.3.4”項下備用的正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20 mL，棄去氨試液，正丁醇液水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL，過0.45 μm的微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液。

2.4.5 陰性供試品溶液的制備 取處方中除黃芪外其余藥物按“2.4.4”項制備方法，制成黃芪陰性供試品溶液。

2.4.6 專屬性實驗 分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.4.1”項色譜條件測定，陰性供試品色譜中，在與黃芪甲苷對照品峰相應的位置上無干擾峰，結果見圖2。

圖2 黃芪甲苷高效液相色譜圖

2.4.7 樣品含量測定 分別精密吸取“2.4.4”項下制備的供試品溶液各10 μL，依次注入高效液相色譜儀，按“2.4.1”項色譜條件測定，計算黃芪甲苷的含量。

2.5 干膏率的測定 精密量取水提液50 mL，置干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，移置干燥器中冷卻30 min，取出后迅速稱定質量，按下式計算干膏率。干膏率（%）＝（干浸膏質量／藥材質量）×100%。

2.6 正交實驗結果 以紫丁香苷含量和黃芪甲苷含量為考察指標進行綜合評價，正交實驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 正交實驗結果

表3 方差分析結果

表2分析結果表明，各因素對紫丁香苷含量和黃芪甲苷提取效果的影響順序為C>B>A，即提取次數>提取時間>加水量，因此，提取次數在新生脈散片的提取工藝中影響最大。表3分析結果表明，提取次數對提取效果的影響有統計學意義（P＜0.05），提取時間、加水量對提取效果的影響無統計學意義。綜合直觀分析和方差分析，同時考慮提高效率及節約能源等因素，優選提取工藝的最佳水平為A2B2C3，即：處方藥材加10倍量水，提取3次，每次1.5 h。

2.7 驗證正交實驗 按正交實驗確定的最佳工藝條件提取3批樣品，分別測定紫丁香苷含量、黃芪甲苷含量、干膏率，結果見表4。

表4 驗證實驗結果

驗證正交實驗結果表明，該提取工藝條件穩定可行，重現性好。因此新生脈散片的最佳提取工藝為：處方藥材加10倍量水，提取3次，每次1.5 h。

3 討論

新生脈散具有益氣、活血、利水的功效，是中醫治療氣虛血瘀水停證的常用方劑，原方以水為溶媒，采用湯劑形式應用于臨床療效顯著。新生脈散片是在原方基礎上開發的新劑型，在保證原方療效的同時，又具有服用量小、服用方便、口感改善、便于保存等優點。

刺五加和黃芪均為方中君藥，紫丁香苷、黃芪甲苷為方中君藥的主要有效成分。因此，為保證全方中主要有效成分的提取效果，以紫丁香苷和黃芪甲苷含量各占50%加權，計算綜合評分，作為提取工藝的考察指標；干膏率是確定制劑規格的重要參數，但由于不參與對療效的貢獻，所以在驗證正交實驗中對其進行考察。

實驗中紫丁香苷及黃芪甲苷的供試品溶液制備方法均為液液提取法，該方法可以實現對紫丁香苷及黃芪甲苷的提取，而采用堿性的氨試液洗滌，可以進一步富集黃芪總皂苷，提高黃芪甲苷轉化率，最終提高黃芪甲苷含量。所建立的供試品溶液制備方法，在保證提取效果的前提下，簡化了操作步驟，便于在實際工作中使用。

實驗中采用超高效液相色譜（UPLC）法測定紫丁香苷的含量，UPLC法較高效液相色譜（HPLC）法更加簡便快速，能得到更高的分析靈敏度，減少有機溶劑的消耗。采用二極管陣列檢測器測定黃芪甲苷的含量時，檢測效果不理想；而采用蒸發光散射檢測（ELSD）器測定時，對照品峰面積的對數值與濃度的對數值呈良好的線性關系。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版（一部）[S].北京：化學工業出版社，2010：192，283.

[2]閻雪梅，賈 凡.扶腎顆粒制備工藝研究[J].天津中醫藥大學學報，2011，30（4）：234－237.

[3]李 康，李 柯，陳 丹，等.刺藍抗疲勞口服液提取工藝的研究[J].中國實用醫藥，2011，6(15)：32-34.

[4]郭美華.刺五加的水提取工藝[J].黑龍江醫藥，2011，24（1）：90－92.

[5]尹 華，張春霞，章建華,等.芪參健骨顆粒的提取工藝研究[J].中國現代應用藥學，2011，28（12）：1106-1109.

[6]賈 媛，惲 菲，常星潔.多指標優選芪葵顆粒提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（20）：27-29.

[7]姜文紅，劉 靜，仲昭慶，等.HPLC法同時測定刺五加浸膏中 3 種有效成分的含量[J].藥物分析雜志，2010，30（6）：1145－1147.

[8]馬志平，陳 濤，李 進，等.丹芪偏癱膠囊中間體的HPLC/DAD/ELSD指紋圖譜研究[J].天津中醫藥大學學報，2009，28（4）：198-200.

[9]張新建，郭美華，劉世萍.高效液相色譜—蒸發光散射檢測器測定安神益心液中黃芪甲苷的含量[J].中國藥物與臨床，2011，11（8）：919－920.