膠質芽孢桿菌液體發(fā)酵產孢條件的優(yōu)化

王金玲，張洪超，2，趙鳳艷，呂長山

(1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱150040;2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122;3.東北農業(yè)大學應用技術學院，黑龍江哈爾濱 150030)

膠質芽孢桿菌(Bacillus mucilaginous)又名膠凍樣芽孢桿菌，國內通常稱之為硅酸鹽細菌［1－2］。農業(yè)上，膠質芽孢桿菌具有解鉀、溶磷作用以及易形成根系優(yōu)勢種特性［3－5］，是目前我國微生物肥料產品中較為重要的一種。工業(yè)方面，膠質芽孢桿菌在無氮培養(yǎng)基或較大的C/N培養(yǎng)基中易產生顯著的胞外多糖莢膜，利用這種多糖的絮凝作用生產優(yōu)勢明顯的微生物絮凝劑前景廣闊［6－7］。冶金工業(yè)上，膠質芽孢桿菌可應用于細菌淋濾和改進某些礦物材料的特性［8］，尤其對低品位礦物的開發(fā)以及回收利用某些有用金屬具有良好的前景。養(yǎng)殖業(yè)方面，膠質芽孢桿菌生長過程產生的蛋白質、有機酸等，可用作飼料補充物，提高飼料的價值［9］。因此提高膠質芽孢桿菌的活菌或芽孢數量與質量具有重要的現實應用意義。本實驗在優(yōu)化的培養(yǎng)基基礎上，通過單因素實驗和正交實驗，考察了發(fā)酵培養(yǎng)條件對產孢量的影響，以期為膠質芽孢桿菌的廣泛應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

膠質芽孢桿菌(Bacillus mucilaginous) 購自中國普通微生物菌種中心，CGMCC1.0910，經紫外誘變處理，本實驗室保存;乳糖、蔗糖、硫酸銨、硫酸錳、磷酸氫二鈉、碳酸鈣、氯化鐵、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀 天津市風船化學試劑科技有限公司，分析純;蛋白胨、瓊脂 北京奧博星生物技術有限責任公司，生物試劑。

SYQ－DSX－280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;ZD－85恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司;HZQ－X100振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;DH－6000A電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;XW－80A旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;XB－K－25血細胞計數板 上海求精生化試劑儀器有限公司;XSZ－4G雙目顯微鏡 北京聯合科儀科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:亞歷氏硅酸鹽細菌培養(yǎng)基，蔗糖5g;磷酸氫二鈉2g;七水硫酸鎂0.5g;氯化鐵0.005g;碳酸鈣0.1g;土壤礦物，取耕層土加入20%鹽酸(耕層土∶鹽酸 =1∶10)煮沸30min，蒸餾水洗至無氯離子，過100 目篩［10］，1.0g;瓊脂30g;蒸餾水1000mL;pH7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基:蔗糖10g;磷酸氫二鉀0.5g;七水硫酸鎂0.5g;碳酸鈣1g;蒸餾水1000mL;pH7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基:乳糖21.57g;復合氮源2.6g;硫酸錳0.21g;磷酸氫二鉀1.5g;七水硫酸鎂1.2g;蒸餾水1000mL;pH7.5。其中，復合氮源質量比為硫酸銨∶蛋白胨 =3∶1。

1.2.2 培養(yǎng)方法 菌種活化:將保存的菌種轉接至斜面培養(yǎng)基，32℃活化24h。

種子搖瓶培養(yǎng):用接種環(huán)挑取3環(huán)菌泥，接入裝有種子培養(yǎng)基 35mL的 250mL三角瓶中，32℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)20h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL，32℃，200r/min振蕩培養(yǎng)24h，然后變溫培養(yǎng)16h。

1.2.3 芽孢計數法 實驗過程中因素與組合的優(yōu)劣比較采用血球計數板計數法［11］，計數前將菌液在80℃水浴槽中熱處理15min。

1.2.4 單因素實驗 培養(yǎng)條件中分別考察接種量、裝液量、發(fā)酵后期溫度、碳酸鈣用量、搖床轉速對實驗結果的影響，每個因素選取7個水平，每實驗3次重復，實驗設計見表1。

表1 單因素實驗因素水平編碼表Table1 Coding list of factors and levels in single factor experiments

1.2.5 正交實驗 根據單因素實驗結果，選擇影響較大的4個因素，確定各因素的中心水平并進行正交實驗，因素及水平見表2。

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1.2.6 驗證實驗 在優(yōu)化所得的最佳培養(yǎng)條件下做菌體生長曲線，進行驗證并獲得最佳培養(yǎng)時間，驗證實驗3次重復。

1.3 數據處理方法

實驗中圖表繪制采用Microsoft Excel處理;正交實驗設計與方差分析應用軟件為正交設計助手Ⅱv3.1。

表2 正交實驗因素及水平表Table2 Factors and levels in orthogonal experiment

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 接種量對發(fā)酵結果的影響 膠質芽孢桿菌最佳接種量實驗結果見圖1。

由圖1可知，接種量從1%增加到7%時，芽孢產量呈現上升趨勢，之后隨接種量的繼續(xù)增大，芽孢產量反而下降。接種量增加，菌體會快速生長并形成芽孢，但接種量超出一定范圍時，由于微生物之間競爭生存空間與培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，同時產生過多的代謝廢物，從而影響芽孢的進一步轉化，因此實驗中選擇7%的接種量為進一步優(yōu)化實驗的中心水平。

圖1 接種量對芽孢產量的影響Fig.1 Effect of inoculated amounts on spore yield

2.1.2 后期溫度對發(fā)酵結果的影響 發(fā)酵工藝參數的優(yōu)化實驗中，菌體生長與芽孢轉化選用不同的培養(yǎng)溫度。根據對膠質芽孢桿菌培養(yǎng)過程中芽孢產量的定期檢測，發(fā)酵的前24h采用較低的32℃，之后的溫度分別提升至34～40℃，水平間隔為1℃，實驗結果如圖2所示。

由圖2可知，膠質芽孢桿菌發(fā)酵過程中適宜于芽孢形成的溫度集中于36～37℃。溫度升高，微生物新陳代謝原有的平衡被打亂，引發(fā)相關酶的活性變化，微生物生長受到影響;當溫度高于37℃時，隨溫度的繼續(xù)升高，膠質芽孢桿菌發(fā)酵所得芽孢量呈現下降趨勢;選擇曲線峰值點即發(fā)酵后期溫度37℃為后續(xù)優(yōu)化實驗的中心值。

2.1.3 碳酸鈣對發(fā)酵結果的影響 膠質芽孢桿菌發(fā)酵過程中的pH呈現動態(tài)變化，當pH低于6.5和高于8.5均對菌體的增殖不利;有研究證實［12］，如果對數生長后期發(fā)酵液的pH不能回升至6，則芽孢與伴孢晶體無法形成，因此控制發(fā)酵液pH對發(fā)酵過程中芽孢的形成與產量具有較大的影響。

膠質芽孢桿菌發(fā)酵最適起始pH為7.5，發(fā)酵過程中通過碳酸鈣調節(jié)發(fā)酵液pH，促進芽孢合成，結果見圖3。

圖2 溫度對芽孢產量的影響Fig.2 Effect of different temperatures on spore yield

圖3 碳酸鈣用量對芽孢產量的影響Fig.3 Effect of calcium carbonate amounts on spore yield

2.1.4 裝液量對發(fā)酵結果的影響 裝液量與膠質芽孢桿菌發(fā)酵過程中的營養(yǎng)物質供給和溶氧量緊密相關，實驗中選取30～90mL的裝液量進行考察，血球計數板計數法結果如圖4所示。

圖4 裝液量對芽孢產量的影響Fig.4 Effect of broth volumes on spore yield

由圖4可見，隨著裝液量的增加，芽孢產量呈現先增加后降低的趨勢，后期下降趨于緩慢;這是由于裝液量在增加營養(yǎng)物質與溶氧量的同時會導致菌體間的激烈競爭，致使容器內代謝廢物大量積累，當超過一定量時，這種反面作用更為突出，以致于對產孢形成抑制作用。實驗中選擇峰值出現時的裝液量60mL為中心水平。

2.1.5 搖床轉速對發(fā)酵結果的影響 發(fā)酵過程中調節(jié)轉速主要是作為發(fā)酵液中溶氧量的調節(jié)手段。膠質芽孢桿菌為好氧性細菌，增大溶氧量有利于菌體的增長。實驗中選取了100～250r/min 7個轉速水平，間隔為25r/min，實驗結果見圖5。

由圖5可見，在100～200r/min轉速范圍內，隨轉速的增加芽孢量明顯增加;在200～250r/min轉速范圍內，芽孢產量增加趨勢變緩，但明顯高于低轉速范圍的產孢量。結果表明，轉速增加有利于芽孢的形成，但轉速繼續(xù)增加會因摩擦作用對菌體與芽孢產生機械破壞作用，實際搖床培養(yǎng)條件也較少高于250r/min，因此實驗優(yōu)選轉速固定為250r/min。

圖5 搖床轉速對芽孢產量的影響Fig.5 Effect of rotate speed on spore yield

2.2 正交實驗

根據單因素實驗結果，搖床轉速固定于250r/min，其他因素以單因素最佳值為中心進行適當擴大，進行正交實驗，因素及水平的設計見表2，實驗設計及結果見表3，方差分析見表4。

表3 正交實驗結果Table3 Results of the orthogonal experiment

由表3可知，影響芽孢產量的因素順序是:接種量＞碳酸鈣用量＞裝液量＞溫度;其中碳酸鈣用于調節(jié)發(fā)酵過程中的pH，實驗結果表明碳酸鈣用量與接種量這兩個因素對發(fā)酵效果影響較為顯著。膠質芽孢桿菌發(fā)酵的最佳工藝參數組合為A3B2C1D3，即裝液量為70mL/250mL，發(fā)酵后期溫度為37℃，接種量為5%，碳酸鈣用量為6g/1000mL。

由表4方差分析可以看出，接種量和碳酸鈣用量對芽孢產量的影響顯著，其他兩項的影響不顯著，此結果與正交實驗結果的極差分析結論一致。

表4 正交實驗結果方差分析Table4 Variance analysis of the results

2.3 生長曲線驗證實驗

以上述實驗所得的最佳培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，以血球計數板計數芽孢數，做膠質芽孢桿菌的生長曲線如圖6所示。經驗證，培養(yǎng)36h芽孢數量最大，血球計數板計數顯示芽孢數量為9.3×109cfu/mL，培養(yǎng)40h芽孢數量為8.7×109cfu/mL，所得結果與正交實驗結果相符。

圖6 膠質芽孢桿菌的生長曲線Fig.6 Growth curve of Bacillus mucilaginosus

3 討論

目前關于膠質芽孢桿菌發(fā)酵的研究主要集中于提高產菌量［14］與抑制胞外多糖［15］的產生方面。不同的膠質芽孢桿菌菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)下產生的活菌數或者芽孢數量存在較大差異。與提高產菌量相比，在提高芽孢產量方面，復合氮源的篩選與搭配、發(fā)酵后期溫度與通氧量的調整［11］、發(fā)酵過程中pH的調整也有少量的研究［16］。吳向華和劉五星［17］對一株自行篩選的膠質芽孢桿菌的培養(yǎng)條件研究結果顯示，培養(yǎng)基起始 pH7.5，培養(yǎng)溫度 36℃，裝液量30mL/250mL錐形瓶;在此基礎上利用70L發(fā)酵罐進行發(fā)酵，培養(yǎng)周期33h，芽孢量可以達到9.58×108cfu/mL;此結果與胡秀芳等人［16］的研究結果相似，后者對一株離子束誘變的膠質芽孢桿菌進行了培養(yǎng)條件研究，結果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基的理想配方為:2%淀粉、0.4% 酵母、0.1%K2HPO4、0.1%MgSO4·7H2O、0.5%CaCO3，pH7.5;種子菌經二級擴大培養(yǎng)后，按6%的接種量接入70 L發(fā)酵罐，在32℃進行發(fā)酵，通氧量2.0～2.5vvm，培養(yǎng)周期38～42h，芽孢量可達到9.8 ×108cfu/mL。陳育如等［18］的研究結果顯示膠質芽孢桿菌最佳的培養(yǎng)條件為，pH7、溫度36℃、轉速220r/min、裝液量50mL，細菌菌量可達10.6×108個/mL。本研究中，采用加入碳酸鈣控制發(fā)酵pH，以利于芽孢形成，同時采用變溫培養(yǎng)的方法，結果表明，培養(yǎng)36h芽孢數最大，血球計數板計數顯示芽孢數量為9.3×109cfu/mL，顯著高于其他研究者，這可能與本菌株經過紫外誘變處理有一定關系，采用血球計數板計數與其他方法的不同也會產生影響。

本實驗中得到的發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)條件，可以為工農業(yè)生產膠質芽孢桿菌提供一定參考，但是要應用到工農業(yè)生產，還需要進一步研究放大實驗效果，篩選通氧量，攪拌轉速等條件。

4 結論

膠質芽孢桿菌優(yōu)化后的發(fā)酵工藝參數為:接種量5%，起始pH7.5，碳酸鈣用量6g/1000mL，裝液量70mL/250mL三角瓶，轉速250r/min，發(fā)酵前24h溫度為32℃，之后12h溫度37℃，最佳培養(yǎng)時間36h，所得芽孢數量為9.3×109cfu/mL。實驗結果為膠質芽孢桿菌工農業(yè)生產提供了數據參考。

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