用于殼聚糖降解的復合酶制劑產生菌的篩選

閻賀靜，胡志平，韓曉紅，段春紅，王海波，李 佳，梅雙喜

(武漢生物工程學院生物工程系，湖北武漢 430415)

殼聚糖在自然界中儲量豐富，可再生和可生物降解，由于具有獨特的生物活性，廣泛應用于食品、化工、醫藥、紡織及農林牧等領域。但高分子量的殼聚糖水溶性差，溶于弱酸性介質，粘度高，不易吸收，因此殼聚糖的應用開發受到限制。低分子量殼聚糖具有許多高分子殼聚糖無法相比的生理功能和活性，不僅利于人體吸收，還具有抗腫瘤活性、調節腸道菌群、增強免疫力、抵抗微生物感染、促進止血以及誘導植物產生抗毒素等諸多生理活性［1－6］。這些優點使殼低聚糖在食品、生物醫藥、日用化妝品、農業等方面具有獨特的應用價值。目前殼低聚糖的生產方法主要由殼聚糖降解獲得，其中以化學法和酶解法為主。酶解法是利用專一性酶或非專一性酶對殼聚糖進行降解的方法。因反應條件溫和而被認為極具工業化生產價值。因此，殼聚糖的酶法降解成為目前的研究熱點。國內外研究者不斷提出采用不同的酶及酶解方法制備高活性的殼寡糖［7－10］。其中，殼聚糖酶(EC.3.2.1.132)被認為是制備殼寡糖最理想的酶制劑，其作用專一，適當控制反應條件即能獲得理想分子量的殼寡糖。但由于專一性酶較難獲得，成本過高，難以實現商業化。因此，尋找非專一酶來對殼聚糖進行水解就顯得尤為重要。目前已發現40多種非專一性酶對殼聚糖具有水解活性。其中，效果較為顯著的酶有纖維素酶、果膠酶、脂肪酶、淀粉酶、木瓜蛋白酶等［11－15］。還有研究者發現，采用幾種酶例如纖維素酶、α－淀粉酶、蛋白酶等共同作用于殼聚糖，其水解作用比單一酶強［16］。在適當條件下，用這些酶水解殼聚糖可以得到相對分子質量1000～4000的低聚糖［17］。這些非專一性酶來源廣泛，價格便宜，成為低聚殼聚糖工業化生產的理想選擇。但復合酶的特性及其協同作用的發揮受單一酶的來源及批次的影響很大，最終產品特性隨之波動較大，同時也不利于殼聚糖水解條件的控制。因此，制備性質穩定的復合酶制劑有利于生產過程和產品質量的控制。微生物在固態培養條件下酶系較全，生產力高，且許多情況下固態發酵產真菌酶的溫度和pH穩定性較高［18－19］。本文利用殼聚糖作為唯一碳源，在固態發酵條件下篩選生產多種殼聚糖降解酶的菌種，并考察了該菌所產復合酶中殼聚糖酶、纖維素酶、α－淀粉酶等酶的酶活，同時確定了該復合酶降解殼聚糖的基本條件，并利用有機溶劑分級沉淀對殼聚糖降解產物進行分析，確定了該菌產復合酶在低聚殼聚糖制備方面的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 采自武漢生物工程學院池塘邊、菜地、樹林等處;D(+)－Galacturonic acid(半乳糖醛酸) 購于sigma公司;其他試劑 均為分析純;玉米和豆粕 購于武漢千禾糧貿有限公司;富集培養基1%(NH4)2SO4，0.07%K2HPO4，0.03%KH2PO4，0.5%NaCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.1% 葡萄糖，1%膠體殼聚糖，調pH至6.0，殼聚糖單獨滅菌(115℃，20min);初篩培養基 1%膠體殼聚糖，0.5%(NH4)2SO4，0.2%K2HPO4，0.5%NaCl，0.1%MgSO4·7H2O，2.0%瓊脂，調 pH 至 6.5～7.5，滅菌條件:121℃，20min，殼聚糖膠體液單獨滅菌(115℃，20min);復篩培養基 玉米粉∶豆粕 =3∶5;殼聚糖4%;母液(g/L):MgSO40.5，KH2PO40.5，KCl 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，ZnSO40.1;(NH4)2SO40.5%;含水量(母液加入量)7mL，121℃滅菌30min。

AB104－N型電子分析天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;DJ1C增力電動攪拌器 江蘇省金壇市大地自動化儀器廠;722S可見分光光度計 上海市棱光技術有限公司;DK－8D數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠;電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;SPX－150B－Z型生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;HQ45Z恒溫搖床 武漢中科科儀技術發展有限責任公司;凈化工作臺 濟南康寶凈化設備有限責任公司;80－2B離心機 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產殼聚糖酶菌種的篩選

1.2.1.1 富集培養 取10g土樣置于加有90mL無菌生理鹽水浸泡1h，溫室振蕩30min，將樣品充分打散。靜置后吸1.0mL懸液于液體培養基中30℃振蕩培養48h。

1.2.1.2 初篩 將富集培養液進行梯度稀釋后，均勻涂布于以殼聚糖為唯一碳源的初篩培養基中。于30℃培養3d。選擇平板中菌落周圍透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落進行第二次平板篩選。

將第一次初篩菌種，點接至初篩平板中，每個平板接種4個點，于30℃中培養3d后，選擇透明圈直徑與菌落直徑比值較大者進行斜面保藏用于復篩。

1.2.1.3 復篩 將初篩菌種孢子制備成孢子懸液，接入到復篩固態培養基中，于30℃培養5d。用醋酸緩沖液浸提酶曲4h，過濾得粗酶液，測定粗酶液中殼聚糖酶酶活。

1.2.1.4 復篩菌種初步鑒定 將復篩菌種接種至初篩平板中，30℃培養3d，每天觀察菌落形態并進行記錄。挑取培養3d的菌絲和孢子進行乳酸石碳酸棉蘭染色，顯微鏡觀察菌絲和孢子形態并記錄。根據菌株的形態學特征，參照真菌鑒定手冊對該菌株進行初步鑒定。

1.2.2 復合酶產生菌各種酶酶活測定 將篩選獲得的菌株接入到復篩固態培養基中，一定條件培養3d后，用醋酸緩沖液浸提酶曲4h，過濾得粗酶液，測定粗酶液中殼聚糖酶、纖維素酶酶活、α－淀粉酶、果膠酶、蛋白酶、木聚糖酶和脂肪酶的酶活。

1.2.3 復合酶對殼聚糖的降解作用

1.2.3.1 復合酶降解殼聚糖的溫度 將殼聚糖溶于1%的pH5.0 NaAc－HAc溶液中，配成1%殼聚糖溶液，在不同溫度(40、45、50、55、60℃)下進行酶解，反應時間60min，測定酶解液中還原糖的量。

1.2.3.2 復合酶降解殼聚糖的pH 分別以NaAc－HAc緩沖溶液配制濃度均為1%的pH為3.8、4.4、5.0、5.6、6.2的殼聚糖溶液，在50℃進行酶解，反應時間60min，酶解完成后測定酶解液中還原糖的量。

1.2.3.3 復合酶降解殼聚糖時間的確定 將殼聚糖溶于1%的pH5.0 NaAc－HAc溶液中，配成1%殼聚糖溶液，在50℃進行酶解，測定不同酶解時間(1、2、3、4、5h)酶解液中的還原糖的量。

1.2.4 復合酶降解殼聚糖終產物的分級沉淀 采用甲醇－丙酮分級沉淀法［20］。

1.3 檢測方法

1.3.1 酶活測定 殼聚糖酶酶活根據Yasushi報道的方法測定［21］;纖維素酶酶活根據Bailey報道的方法測定［22］;α－淀粉酶酶活測定在 Fisher等所報道方法進行［23］;果膠酶酶活根據Brühlmann報道的方法測定［24］;木聚糖酶酶活根據 Bailey 的方法測定［25］;蛋白酶酶活采用Foline試劑顯色法測定［26］;脂肪酶酶活根據文獻報道的方法測定［27］。

1.3.2 還原糖的測定 用DNS顯色法測定酶解液中還原糖的量。

1.3.3 蛋白質含量測定 根據Bradford法測定［28］。

以上實驗所有數據均為三次重復實驗的平均值。

2 結果與討論

2.1 產酶菌株的初篩

殼聚糖不溶于水，以殼聚糖為唯一碳源的平板培養基為非透明狀，殼聚糖水解后會使培養基變透明，由此初步判定該菌產的酶能夠降解殼聚糖。從采集的10種土壤樣品中，篩選到6株產酶能力較強的菌株。其菌落周圍透明圈直徑與菌落直徑的比值(D/d)介于0.6～0.9，C－1、C－2 和 C－3 菌株的透明圈較大，結果見表1。

表1 產酶菌株初篩結果Table1 Primary screening results for enzyme production strain

2.2 產酶菌株的復篩

在固態培養基中，微生物產酶量高且酶種類豐富。為了篩選出殼聚糖降解復合酶產生菌，將初篩菌株中透明圈較大者C－1、C－2和C－3接入固態復篩培養基中，發酵后測粗酶液中殼聚糖酶酶活，結果如表2所示。

表2 固態培養復篩結果Table2 Secondary screening results based on solid state fermentation

由表2可見，C－3菌株產殼聚糖酶酶活較高，所以選擇C－3作為進一步研究的對象。

2.3 產酶菌株的形態鑒定

C－3菌株在初篩培養基上培養一段時間后，其菌落形態特征如圖1所示。

圖1 菌落形態特征Fig.1 Colonial morphology of C－3 strain on solid medium

由圖1可見，菌株C－3菌落較大，白色，邊緣呈絨毛狀和絮狀，質地疏松，外觀干燥，不透明，菌絲白色，產綠色孢子，后期呈黑褐色，菌落與培養基間連接緊密，不易被挑取。

進一步對C－3菌株進行乳酸石碳酸棉蘭染色，結果見圖2。在顯微鏡下可見分生孢子頭，頂囊呈綠色燒瓶狀，小梗單層，排列成木柵狀，布滿頂囊表面。頂端有鏈形排列的球狀分生孢子，壁表面光滑，在營養菌絲內可見到明顯的隔。參照真菌鑒定手冊初步判定該菌株為曲霉屬。

圖2 C－3菌株顯微鏡檢結果Fig.2 C－3 microscope examination results

2.4 C－3產復合酶中各種酶酶活

一般情況下，微生物在固態培養基中的酶系比較豐富。測定C－3固態發酵產復合酶中蛋白質的含量和各種酶的酶活，有利于考察該復合酶的主要酶組分和其含量。C－3復合酶酶液中各酶活及比活力結果如表3所示。

由表3可見，菌株C－3固態發酵酶液中含有多種酶。其中，α－淀粉酶酶活最大為3.229U/mL，殼聚糖酶和纖維素酶的酶活分別為2.206、0.790U/mL。值得注意的是，表3中殼聚糖的水解活性并不是指殼聚糖酶酶活，而是復合酶對殼聚糖降解作用的綜合酶活。是復合酶中纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等降解殼聚糖的協同作用的表現。據文獻報道，纖維素酶來源廣泛，且對殼聚糖具有較好的水解作用［11］;同時 Pan Sai－kun［14］的報道表明，α－淀粉酶對殼聚糖也有一定的降解作用;其次，果膠酶、脂肪酶及蛋白酶對殼聚糖的降解作用也有報道［12－13］。另外，有研究表明，將纖維素酶、α－淀粉酶、蛋白酶等共同用于殼聚糖的降解，其作用優于單一酶［16］。由此可見，C－3產復合酶中的主要酶制劑均是對殼聚糖有較好降解作用的非專一性酶。由此可以初步推斷，C－3復合酶應對殼聚糖有一定的降解作用。

表3 C－3固態發酵酶液中不同酶的酶活及比活力Table3 Different enzymes activity and its specific activity in C－3 solid state fermentation enzyme preparation

2.5 C－3復合酶降解殼聚糖的作用條件

2.5.1 復合酶降解殼聚糖的溫度 由圖3可知，在實驗溫度范圍內，隨溫度的升高還原糖的量迅速增加，50℃時達到最高。之后隨溫度的升高，還原糖的量顯著降低。表明，該復合酶降解殼聚糖的最適溫度為50℃。

圖3 溫度對C－3復合酶降解殼聚糖的影響Fig.3 Effect of temperature on chitosan degradation for C－3 complex enzymes

2.5.2 復合酶降解殼聚糖的pH 由圖4可見，反應pH由3.8增至5.6時，還原糖的量明顯增加;在pH5.6～6.2范圍內，反應體系產還原糖的量變化不大。說明此復合酶在pH5.6到pH6.2范圍內較為穩定。由于殼聚糖溶于微酸環境，繼續增加反應pH將無法保證酶促反應的順利進行。因此，確定C－3復合酶降解殼聚糖的適宜pH為5.6～6.2。

2.5.3 復合酶降解殼聚糖的酶解時間 對C－3復合酶降解殼聚糖的酶解時間的考察發現，在酶解初期還原糖釋放量迅速增加，但酶解時間達到4h后，繼續延長時間，反應體系中還原糖的量增加趨緩。這可能是由于酶的失活或底物的減少及產物的增加所造成的。因此，酶解時間以4h為宜。

圖4 pH對C－3復合酶降解殼聚糖的影響Fig.4 Effect of pH on chitosan degradation for C－3 complex enzymes

圖5 C－3復合酶酶解時間對殼聚糖降解的影響Fig.5 Effect of inculbation time on chitosan degradation for C－3 complex enzymes

2.5.4 復合酶降解殼聚糖終產物分析 分子量對殼聚糖的性質有很大影響，不同分子量的殼聚糖性質差異很大，殼聚糖的許多獨特功能只有在分子量降低到一定程度時才表現出來。殼聚糖酶解產物是判斷C－3復合酶是否具有應用價值的依據之一。據Muraki報道，DP＞16的低聚殼聚糖不溶于50%的甲醇溶液，8＜DP＜16的低聚殼聚糖溶于50%甲醇溶液而不溶于90%甲醇溶液，同時DP＜8的低聚殼聚糖溶于90%甲醇溶液而不溶于90%丙酮溶液［20］。本實驗采用甲醇－丙酮分級沉淀可以考察酶解產物中各種低聚殼聚糖的含量，結果如表4所示。

表4 C－3復合酶降解殼聚糖產物的含量Table4 Components of the products from chitosan degradation with C－3 complex enzymes

使用的殼聚糖原材料的聚合度(DP)約為500，由表4可知，殼聚糖經C－3復合酶降解后，8＜DP＜16和DP＜8的產物量分別占總產物的27.9%和41.16%。許多研究表明，聚合度為2～10的殼聚糖具有許多獨特的新功能，特別是聚合度6～8的殼寡糖具有高活性的抗腫瘤作用［29］。聚合度3～7的殼寡糖可以增加鈣的吸收，從而降低糞便鈣的排泄［30］。另外，有研究認為，分子量1500左右的殼寡糖抗菌活性大大高于高分子量的殼聚糖［31］。由此可推斷，C－3復合酶在低聚殼聚糖生產方面具有一定的應用潛力。

3 結論

從土壤中篩選出一株降解殼聚糖的復合酶產生菌C－3，該菌株初步鑒定為曲霉菌。C－3復合酶中以殼聚糖酶、纖維素酶、α－淀粉酶為主，它們的酶活分別為2.206、0.790、3.229U/mL。該復合酶降解殼聚糖的條件為溫度50℃，pH5.6，酶解時間為4h。該復合酶降解殼聚糖的酶解產物中以DP＜16的殼寡糖為主，表明該復合酶在殼寡糖制備方面具有一定應用潛力。

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