交聯大豆分離蛋白的制備及流變學性質

姜 畔，趙新淮

(乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學，黑龍江哈爾濱 150030)

酶法交聯修飾因其反應條件溫和、反應程度易于控制，而被廣泛地用于改善蛋白質的功能性［1］?？纱呋澄锏鞍捉宦摰拿割愔饕修D移酶中的轉谷氨酰胺酶［2］，以及氧化酶中的酪氨酸酶［3］、葡萄糖氧化酶［4］和過氧化物酶［5］。Mattinen 等［6］研究證實，酪氨酸酶可以導致牛血清白蛋白和β－酪蛋白的交聯。Bonet等［4］利用葡萄糖氧化酶交聯谷蛋白改善生面團流變學特性，從而改善面包的烘焙特性。F?rgemand 等［7］對在 H2O2存在時，辣根過氧化物酶聚合乳清蛋白進行了研究，發現辣根過氧化物酶可促使乳清蛋白中的β－乳球蛋白發生交聯從而導致蛋白聚合體生成。在H2O2存在的情況下，辣根過氧化物酶可使蛋白質中酪氨酸殘基氧化，進而形成二酪氨酸使蛋白質分子得以交聯［8－9］。通過辣根過氧化物酶修飾后，蛋白質的表面疏水性、乳化性及表觀黏度等功能性質有顯著改善［10］。利用一種氧化酶修飾食品蛋白質的研究已有很多，但利用兩種氧化酶協同修飾食品蛋白質的研究還很少見。為此，本研究利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖產生H2O［11］2，再利用辣根過氧化物酶和H2O2對大豆分離蛋白進行修飾;以修飾產物中相對二酪氨酸含量為指標，采用單因素實驗確定一步法處理的適宜條件，并對反應產物及產物酸凝膠的流變學性質進行評價，為蛋白質修飾技術新方法的開發提供初步依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂蛋白粉 哈爾濱高科技蛋白有限公司;葡萄糖氧化酶 西格瑪奧德里奇中國有限公司;葡萄糖 天津基準化學試劑有限公司;辣根過氧化物酶上海國源生物技術有限公司;葡萄糖－δ－內酯 鄭州陽光化工產品有限公司;鹽酸 天津市耀華化工廠;氫氧化鈉 北京益利精細化學品有限公司;硼酸 天津市東麗區天大化學試劑廠;碳酸氫鈉、無水碳酸鈉 天津市巴斯夫化工有限公司。

F－4500型熒光分光光度計 日本日立公司;Gemini II高級流變儀 英國Malvern公司;HZQF160型全溫振蕩培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司;DK－98－1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白的制備 大豆分離蛋白的制備參照 Zhang 等人［12］的方法。

1.2.2 一步法交聯處理適宜條件的選擇 配制蛋白質濃度約為4%(w/v)的大豆分離蛋白母液，用0.2mol/L NaOH調節pH至7.0后在92℃水浴加熱10min，使蛋白質完全變性。采用單因素實驗，通過測定反應后交聯產物的相對熒光強度(即相對二酪氨酸含量)，考察葡萄糖添加量、葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶和反應時間對交聯產物中相對二酪氨酸含量的影響。反應體系大豆分離蛋白終濃度為3%(w/v)，葡萄糖添加量分別為0.18%、0.90%、1.8%、3.6%和7.2%，葡萄糖氧化酶添加量分別為1、2、4、6、8U/g蛋白質，辣根過氧化物酶添加量分別為100、200、300U/g蛋白質。反應混合物置于37℃恒溫培養箱內振蕩培養，反應時間分別為 0.5、1、2、3、4h。反應結束后，85℃水浴滅酶10min。待反應液冷卻至室溫后測定其相對熒光強度。

1.2.3 蛋白質含量的測定 采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5－2003);鹽酸標準滴定溶液配制方法－GB/T 5009.1－2003;溴甲酚綠－甲基紅混合指示劑配制方法－GB/T 5009.1－2003。

1.2.4 交聯蛋白及其酸凝膠的制備 在一步法交聯處理選擇的適宜條件下，制備一步法處理和兩步法處理的交聯蛋白樣品，在兩步法處理中，首先使用葡萄糖和葡萄糖氧化酶對大豆分離蛋白處理1h后再加入辣根過氧化物酶繼續處理2h，反應結束后，85℃水浴滅酶10min，待樣品冷卻后凍干。

酸化凝膠的制備及其流變學測定參照Li等人的方法［13］。配制質量分數為4%(w/v)的大豆分離蛋白和兩種交聯蛋白的分散液，調節pH至6.8，40℃下添加葡萄糖－δ－內酯(添加量為0.15g/g蛋白質)后攪拌2min，使其充分混合，40℃下保溫2h，形成酸化凝膠(反應后凝膠的終pH約為4.3)。

1.2.5 流變學性質分析 分別配制質量分數為10%的大豆分離蛋白和兩種交聯蛋白的分散液，調節pH至7.0，選用夾具為錐板(PP40/4°)。將樣品分散液緩慢傾注充滿夾具，溢出的多余部分用專用的塑料刮勺刮去，蓋好保溫套，在測量溫度25℃下平衡5min。

表觀黏度測定:剪切速率的范圍為0.1～100s－1，取30個點進行測試。

黏彈性測定:在頻率為1Hz下進行振幅掃描，選定應變為0.28%，以保證所測試樣品在線性黏彈區域內;然后在0.1～10Hz下進行頻率掃描［13］。

葡萄糖－δ－內酯酸化凝膠的流變學測試采用下述條件和方法。選用夾具為平板PP60，測試間距為1mm，上述分散液添加葡萄糖－δ－內酯(添加量為0.15g/g蛋白質)后攪拌2min，再將樣品分散液緩慢傾注充滿夾具，溢出的多余部分用專用的塑料刮勺刮去，蓋好保溫套，于測量溫度40℃平衡5min。

時間掃描:測定參數條件為頻率1Hz，測試應變為1%，測試時間120min。

溫度掃描:測定參數條件為加熱溫度變化40～85℃，加熱速率0.5℃/min，測試應變為1%。

1.2.6 相對二酪氨酸含量測定 將樣品用0.2mol/L的碳酸鹽緩沖溶液(pH9.5)稀釋到0.5g/L，在激發波長320nm，發射波長410nm，間隙500μm下測定相對熒光強度(即相對二酪氨酸含量)［14］。

1.2.7 數據統計分析 采用SPSS13.0軟件中Duncan’s多重比較對實驗數據進行統計分析(α=0.05)，利用Excel 2003軟件繪圖報告結果，其中每組實驗或分析重復數為3次。

2 結果與討論

2.1 葡萄糖添加量對相對二酪氨酸含量的影響

由圖1可見，在反應條件為蛋白質分散液質量分數為3%、葡萄糖氧化酶添加量4U/g蛋白質、辣根過氧化物酶添加量200U/g蛋白質、反應時間3h時，隨著葡萄糖添加量從0增加到1.8%，交聯蛋白中的相對二酪氨酸含量呈顯著升高趨勢;當葡萄糖添加量高于1.8%時，交聯蛋白中的相對二酪氨酸含量隨著葡萄糖添加量的增加反而呈顯著降低趨勢;因此，適宜的葡萄糖添加量為1.8%。

圖1 葡萄糖添加量對交聯蛋白中的相對二酪氨酸含量的影響Fig.1 Impacts of glucose addition on relative dityrosine content of the cross－linked proteins

2.2 葡萄糖氧化酶添加量對相對二酪氨酸含量的影響

由圖2可見，在反應條件為蛋白質分散液質量分數為3%、葡萄糖添加量1.8%、辣根過氧化物酶添加量200U/g蛋白質、反應時間3h時，當葡萄糖氧化酶添加量小于4.0U/g蛋白質時，隨著葡萄糖氧化酶添加量的增加，交聯蛋白中的相對二酪氨酸含量呈顯著升高趨勢;但當葡萄糖氧化酶添加量高于4.0U/g蛋白質時，交聯蛋白中的相對二酪氨酸含量隨著葡萄糖添加量的增加而呈顯著降低趨勢。因此，適宜的葡萄糖氧化酶添加量為4.0U/g蛋白質。

2.3 辣根過氧化物酶添加量對相對二酪氨酸含量的影響

由圖3可見，在反應條件為蛋白質分散液質量分數為3%、葡萄糖添加量1.8%、葡萄糖氧化酶添加量4U/g蛋白質、反應時間3h時，隨著辣根過氧化物酶添加量的增加，交聯蛋白中的相對二酪氨酸含量呈顯著升高趨勢。在辣根過氧化物酶添加量從200U/g蛋白質增加到300U/g蛋白質時，添加量增加50%，而交聯蛋白的相對熒光強度只增加3%?？紤]辣根過氧化物酶的成本，故此，選擇辣根過氧化物酶添加量為200U/g蛋白質。

圖2 葡萄糖氧化酶對交聯蛋白中的相對二酪氨酸含量的影響Fig.2 Impacts of glucose oxidase addition on relative dityrosine content of the cross－linked proteins

圖3 辣根過氧化物酶對交聯蛋白中的相對二酪氨酸含量的影響Fig.3 Impacts of HRP addition on relative dityrosine content of the cross－linked proteins

2.4 反應時間對相對二酪氨酸含量的影響

由圖4可見，在反應條件為蛋白質分散液質量分數為3%、葡萄糖添加量1.8%、葡萄糖氧化酶添加量4U/g蛋白質、辣根過氧化物酶添加量200U/g蛋白質，當反應時間小于3h時，隨著反應時間的延長，交聯蛋白的相對熒光強度呈顯著升高趨勢;當反應時間大于3h時，交聯蛋白的相對熒光強度呈降低趨勢。故此，適宜的反應時間為3h。

綜上，在蛋白質分散液質量分數為3%時，一步法交聯反應的適宜條件為葡萄糖添加量為1.8%、葡萄糖氧化酶添加量為4.0U/g蛋白質、辣根過氧化物酶添加量為200U/g蛋白質和反應時間為3h;一步法和二步法處理的交聯蛋白，其相對二酪氨酸含量分別為414和381。因此，一步法處理比二步法處理更能促進大豆分離蛋白交聯。

2.5 交聯產物的性質表征

圖4 反應時間對交聯蛋白中的相對二酪氨酸含量的影響Fig.4 Impacts of reaction time on relative dityrosine content of the cross－linked proteins

2.5.1 剪切速率對表觀黏度的影響 從圖5可以看出，原料蛋白及2個交聯蛋白的分散液皆表現出剪切變稀現象。二元酶系處理的交聯蛋白分散液的表觀黏度皆高于原料蛋白分散液，并且一步法處理的效果要高于二步法處理。Rha［15］等的研究證明:大豆分離蛋白為牛頓流體，表現為剪切變稀;這與本研究一致。F?rgemand［7］等證明交聯會導致蛋白中形成大分子物質，使其表觀黏度升高。Hiller和Lorenzen［16］對酪蛋白的交聯研究進一步證明交聯處理會引起表觀黏度增加。

圖5 剪切速率對交聯蛋白分散液表觀黏度的影響Fig.5 Impacts of shear rates on apparent viscosity of the dispersion of the cross－linked proteins

2.5.2 交聯處理對黏彈性的影響 從圖6中的結果可以看出，3種蛋白質樣品分散液的黏性模量、彈性模量由大到小依次為:一步法交聯蛋白分散液、二步法交聯蛋白分散液、大豆分離蛋白分散液。

蛋白質分散液的表觀黏度與蛋白質分子大小、溶劑與蛋白質間的相互作用以及蛋白質與蛋白質間的相互作用有關［17］。Chang等的研究證明，經二元酶系(葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶)和葡萄糖處理，酪蛋白中有大分子物質形成，并導致其表觀黏度、黏性模量和彈性模量增加［18］。因此，本研究得到的交聯蛋白具有更好的流變學性質。

2.5.3 交聯處理對酸化凝膠彈性模量影響 圖7給出了大豆分離蛋白、一步法交聯蛋白、二步法交聯蛋白在形成酸化凝膠時，時間掃描和溫度掃描結果。由此得到的成膠時間、成膠溫度分別列于表1。

表1數據顯示，二元酶系(葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶)和葡萄糖處理可以顯著降低大豆蛋白酸凝膠的膠凝溫度和膠凝時間。葡萄糖－δ－內酯可以降低蛋白體系的pH至蛋白的等電點，從而使蛋白相互聚集，溶解度下降，最終形成凝膠。楊國龍［19］等的研究表明:在pH4.3時(等電點附近)，蛋白質分子間的靜電相互作用很弱，蛋白質－蛋白質間還有疏水相互作用，疏水相互作用越強，凝膠化溫度越低，凝膠化時間越短。而酪蛋白經二元酶系(葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶)和葡萄糖處理后疏水性增強［20］。所以，二元酶系交聯處理有利于大豆蛋白分子之間形成網絡結構。因此，降低了凝膠化溫度、縮短了凝膠化時間。

圖6 交聯處理方法對交聯蛋白黏彈性的影響Fig.6 Impacts of cross－linking treatment on viseoelastieity of the dispersion of the cross－linked proteins

圖7 處理方法對酸化蛋白質凝膠彈性模量影響Fig.7 Impacts of cross－linking treatment on elastic modulus of the acid－induced protein gels

表1 交聯處理對大豆分離蛋白成膠溫度和成膠時間的影響Table1 Impacts of cross－linking treatment on gelation temperature and gelation time of the soybean protein isolate

3 結論

3.1 采用一步法，制備交聯大豆分離蛋白的適宜條件為:葡萄糖添加量為1.8%，葡萄糖氧化酶添加量4.0U/g蛋白質，辣根過氧化物酶添加量200U/g蛋白質，反應時間3h。

3.2 經二元酶系處理后的大豆分離蛋白，其彈性模量和黏性模量提高。

3.3 與大豆分離蛋白相比，經二元酶系一步法和二步法處理后，交聯蛋白酸凝膠的成膠時間分別縮短15.3%和20.8%，而成膠溫度分別降低14.5%和16.1%。

［1］Mannheim A，Cheryan M.Enzyme－modified proteins from corn gluten meal:preparation and functional properties［J］.Journal of American Oil Chemists’Society，1992，69(12):1163－1169.

［2］梁華民，田少君，周怡，等.轉谷氨酞胺酶對大豆分離蛋白交聯聚合作用研究［J］.糧食油脂，2004，1(2):3－6.

［3］Partanen R，Torkkeli M，Hellman M，et al.Loosening of globular structure under alkaline pH affects accessibility of βlactoglobulin to tyrosinase－induced oxidation and subsequent cross－ linking［J］.Enzyme and Microbial Technology，2011，49(2):131－138.

［4］Bonet A，Rosell C M，Caballero P A，et al.Glucose oxidase effect on dough rheology and bread quality:a study from macroscopic to molecular level［J］.Food Chemistry，2006，99(2):408－415.

［5］Heijnisa W H，Wierenga P A，Janssen A E M，et al.In－line quantification ofperoxidase－catalyzed cross－linking of(－lactalbumin in a microreactor［J］.Journal of Chemical Engineering，2010，157(2):189－193.

［6］Mattinen L M，Lantto R，Selinheimo E，et al.Oxidation of peptides and proteins by Trichoderma reesei and Agaricus bisporus tyrosinases［J］.Journel of Biotechnol，2008，133(3):395－402.

［7］F?rgemand M，Otte J，Qvis K B，et al.Cross－linking of whey proteins by enzymatic oxidation［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(4):1326－1333.

［8］Stahmann M A，Spencer A K，Honold G R，et al.Cross linking of proteins in vitro by peroxidase［J］.Biopolymers，1977，16(6):1307－1318.

［9］Matheis G，Whitaker J R.Peroxidase－catalyzed cross linking of proteins［J］.Journal of Protein Chemistry，1984，3(1):35－48.

［10］Hiller B，Lorenzen P C.Properties of set－ style skim milk yoghurt as affected by an enzymatic or Maillard reaction induced milk protein oligomerisation［J］.Journal of Food Science and Technology，2011，44(4):811－819.

［11］Rasiah I A，Sutton K H，Low F L，et al.Cross－linking of wheat dough proteins by glucose oxidase and the resulting effects on bread and croissants［J］.Food Chemistry，2005，89(4):325－332.

［12］Zhang Y N，Liu N，Zhao X H.A study on the preparation and some functional properties of a cross－linked casein－gelatin composite by a microbial transglutaminase［J］.International Journal of Food Science and Technology，2011，46(12):2641－2647.

［13］Li F，Kong X Z，Zhang C M，et al.Gelation behaviour and rheological properties of acid－induced soy protein－stabilized emulsion gels［J］.Food Hydrocolloids，2012，29(2):347－355.

［14］Davies K J，Delsignore M E，Lin S W，et al.Protein damage and degradation by oxygen radicals.II.modification of amino acids［J］.Journal of Biological Chemistry，1987，262(20):9902－9907.

［15］Rha C K.Rheology of fluid foods［J］.Food Technology，1978，32(7):77－82.

［16］Hiller B，Lorenzen P C.Functional properties of milk proteins as affected by enzymatic oligomerisation［J］.Food Research International，2009，42(8):899－908.

［17］Jiang S J，Zhao X H.Transglutaminase－ induced crosslinking and glucosamine conjugation of casein and some functional properties of the modified product［J］.International Dairy Journal，2011，21(4):198－205.

［18］Damodaran S.Amino acids，peptides，and proteins［M］.In Food Chemistry(3rd edition);Fenema O R;Eds.;Marcel Dekker，Inc.:New York，USA，1996，321－429.

［19］楊國龍，趙謀明，楊曉泉，等.改性大豆蛋白的凝膠流變性［J］.中國糧油學報，2007，22(6):43－46.

［20］Chang C H，Zhao X H.In vitro digestibility and rheological properties of the caseinates treated by an oxidative system containing horseradish peroxidase，glucose oxidase and glucose［J］.International Dairy Journal，2012，27(1－2):47－52.