火龍果果皮色素的提取及其抗氧化活性的研究

王標詩，王文青，麥潔明，江 敏，金 蓓，杜建中，李汴生

(1.湛江師范學院化學科學與技術學院，廣東湛江 524048;2.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640)

火龍果，本名青龍果、紅龍果。火龍果樹為仙人掌科的三角柱屬植物，原產于巴西、墨西哥等中美洲熱帶沙漠地區，屬典型的熱帶植物。火龍果是一種由南洋引入臺灣，再由臺灣改良引進海南省及大陸南部廣西、廣東等地栽培的植物。火龍果因其外表肉質鱗片似蛟龍外鱗而得名［1－3］。火龍果營養豐富、功能獨特，它含有一般植物少有的植物性白蛋白及花青素，豐富的維生素和水溶性膳食纖維。火龍果的品種按其果皮果肉的顏色分為紅皮白肉、紅皮紅肉、黃皮白肉等 3 種［4－5］，其所含的植物性白蛋白，具粘性，膠質性，對重金屬中毒者有解毒功效，對胃壁有保護作用。果皮中的花青素具有抗氧化、抗自由基、延緩衰老作用，能預防腦細胞變性，抑制老年性癡呆的發生;含可溶性膳食纖維，能降血糖，預防大腸癌等等［5－6］。火龍果果實富含大量的天然色素，從皮到肉的顏色呈玫瑰紅到紫紅色，是天然色素提取加工的良好來源［7］。目前火龍果的開發項目主要有酵素產品開發、天然食用色素開發、烈性果酒制作、種子油提取［8］、凝膠汁美容護膚、化妝產品研制［9］和果膠［10］等，但對火龍果果皮的利用開發鮮有報道。火龍果皮是火龍果品加工的副產物。利用食用和加工中丟棄的果皮提取色素，不但可以化廢為寶，且可以大大提高火龍果的綜合利用開發價值。因此，研究火龍果皮色素及其功能性質有著深遠的意義。可以實現對菠蘿皮渣的高值化綜合利用，不僅有利于解決環境問題，還將帶來良好的經濟效益。目前，有關火龍果果皮色素的研究僅限于不同種類的火龍果果皮色素的提取純化及穩定性等方面［11－12］，而有關火龍果果皮色素抗氧化活性的研究尚未見報道。本研究以火龍果果皮為對象，利用有機溶劑提取色素，優化提取工藝條件，并研究其抗氧化活性。此研究的開展可以充分利用火龍果資源，為火龍果的深加工和副產物利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白色果肉火龍果果皮 購于當地市場;無水乙醇 廣東光華化學廠有限公司;1，1－二苯－2－苦肼基(DPPH) 上海品純試劑有限公司;鄰二氮菲、磷酸氫二鈉 天津市大茂化學試劑廠;磷酸二氫鈉 天津市光復精細化工研究所;30%過氧化氫 廣東汕頭市西隴化工廠;硫酸亞鐵 天津市科密歐化學試劑開發中心;三羥甲基氨基甲烷 上海一帆試劑有限公司;焦性沒食子酸 浙江省溫州市東升化工試劑廠;氯化鈉 天津市大茂有限公司;氯化鉀 天津市大茂集團有限公司;以上及其他化學試劑均為分析純。

HH－4數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;PHS－3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司;DHG－9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱、V－1100D可見分光光度計 上海精宏實驗設備有限公司;FA2104N型電子精密分析天平 上海濟成分析儀器有限公司;HH－數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;80－2電動離心機 金壇市新航儀器廠;KYC－100C空氣恒溫搖床 上海福瑪實驗設備有限公司;C型玻璃儀器氣流烘干器 長城科工貿有限公司;JYL－350A九陽料理機 九陽股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 火龍果果皮色素的提取工藝研究

1.2.1.1 原料預處理 將當地市場上新鮮的火龍果果皮取出，去除附在上面的綠色部分的果皮。將紅色部分的果皮剪成3～4cm2大小的小塊，于烘箱中60℃烘12h，冷卻到室溫，用料理機粉碎成粉末貯于干燥帶塞的玻璃瓶，置于干燥陰涼的地方待用。

1.2.1.2 單因素實驗方法 稱取一定量烘干的粉末狀火龍果果皮若干份，分別在不同的料液比、提取時間、提取溫度等條件下進行單因素平行實驗，各反應液分別以相應的DPPH·清除率為指標，得出適宜的條件。

稱取 1g火龍果皮粉，分別加入 11、12、13、14、15mL 90%乙醇提取色素液，25℃恒溫水浴并振蕩(150r/min)2h后離心過濾。并測定各提取液對DPPH·的清除率，確定最適的料液比。

稱取1g火龍果皮于6支帶塞大試管中，加入等量的90%的乙醇，室溫下提取色素，每隔30min測定各提取液對DPPH·的清除率，確定最適提取時間。

稱取等量火龍果皮粉，按一定的料液比，分別置于25、30、35、40℃四個不同溫度下恒溫水浴鍋中振蕩(150r/min)，提取2h后離心，測定各提取液對DPPH·的清除率，確定最適的提取溫度。

1.2.1.3 正交實驗方法 采用正交實驗設計，應用L9(34)正交表，對料液比、提取溫度、提取時間進行3因素3水平實驗(見表1)，以提取液對DPPH的清除率為指標，得出提取火龍果果皮色素的最佳條件。

表1 正交實驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.2 火龍果果皮色素的抗氧化性研究

1.2.2.1 火龍果果皮色素提取液對DPPH·的清除作用 參考文獻［13－14］。取0.0002mg/mL的 DPPH·溶液(用無水乙醇配制)2mL，加入不同濃度的提取液2mL，室溫反應30min，測定其在517nm處的吸光度值，空白組以2mL無水乙醇代替試樣，并按式(1)計算清除率:

1.2.2.2 火龍果果皮色素提取液對羥自由基(·OH)的清除作用 參考文獻［15－16］。取pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液2.0mL，依次加入7.5mmol/mL鄰二氮菲2.0mL，7.5mmol/mL硫酸亞鐵溶液2.0mL，不同濃度的提取液1.0mL，0.01%過氧化氫1.0mL，每加一種溶液都要充分混勻。將反應體系置于37℃恒溫水浴鍋中，反應1h后離心，取上層清液，測定其在536nm處吸光度，為A1。用蒸餾水代替樣品提取液測得的吸光度為A2，用蒸餾水代替樣品提取液和過氧化氫所得的吸光度為A3，然后按式(2)計算清除率:

1.2.2.3 火龍果果皮色素提取液對超氧陰離子自由基的清除作用 參考文獻［17－18］。取 4.5mL 0.05mol/L Tris－HCl緩沖液(pH8.2)于試管中，置于25℃水浴中預熱20min，加入不同濃度的火龍果皮色素提取液1mL，2.5mol/L鄰苯三酚0.4mL，混勻后在25℃水浴中反應4min，立即用8mol/L HCl兩滴終止反應，并在420nm處測定吸光度(用蒸餾水調零)，空白組的用1mL蒸餾水代替樣品，并按式(3)計算清除率:

以上實驗均平行三次，實驗結果以均值±標準偏差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 火龍果果皮色素提取工藝研究

2.1.1 乙醇濃度選擇結果 不同乙醇濃度對火龍果果皮色素清除DPPH·的結果見圖1。在乙醇濃度為50%～90%時，火龍果果皮色素提取液對DPPH·的清除率都超過90%，而當乙醇濃度為100%時，火龍果果皮色素提取液對DPPH·的清除率反而顯著降低(p＜0.05)。由于濃度低于70%時，火龍果果皮色素提取液的粘度較高，顏色也較深，說明提取液所含有的雜質較多，綜合考慮，本實驗選擇90%的乙醇作為提取試劑。

圖1 乙醇濃度對火龍果果皮色素提取液DPPH·清除率的影響Fig.1 Effect of ethanol content on scavenging DPPH free radical of the pigment from pitaya peel

2.1.2 料液比的選擇結果 料液比對火龍果果皮色素清除DPPH·的結果見圖2。由圖2可知，火龍果皮提取液對DPPH·的清除率在一定的料液比范圍內呈逐漸增大的趨勢，在所研究的料液比范圍內最低可達93.0%，當料液比為1∶14(g/mL)時，又有所下降，在1∶15(g/mL)達到最佳，可達 97.2%，之后又有所下降。可能由于達到最高清除率后再提高料液比，色素濃度被稀釋，清除率又會下降。故綜合考慮，選擇料液比為 1∶14、1∶15、1∶16(g/mL)作為正交實驗的3個水平。

圖2 料液比對火龍果果皮色素提取液DPPH·清除率的影響Fig.2 Effect of rate of material to liquid on scavenging DPPH free radical of the pigment from pitaya peel

2.1.3 提取時間的實驗結果 提取時間對火龍果果皮色素清除DPPH·的結果見圖3。由圖3可知，火龍果皮色素提取液對DPPH·的清除率先降低后增加，而后趨于不變，其中在90min時達到最低為85.1%，在120、150、180min 處均高于94%，且變化不大，當達到一定時間后，再延長時間，色素提取液清除率基本上不發生變化，說明色素基本上被提取完全。故綜合考慮，選擇提取時間為120、150、180min作為正交實驗的三個水平。

2.1.4 提取溫度的選擇結果 提取溫度對火龍果果皮色素清除DPPH·的結果見圖4。由圖4可知，溫度對DPPH·的清除率影響不是很大，先略有降低后增加，之后再降低，說明火龍果色素有最適提取溫度，溫度過高可能影響色素的穩定性。在35℃時清除率達到最高為95.6%，25和30℃時的清除率都要高于40℃時的清除率，再結合實驗條件的方便性選擇25、30、35℃三個提取溫度作為正交實驗的三個水平。

圖3 提取時間對火龍果果皮色素提取液DPPH·清除率的影響Fig.3 Effect of extracting time on scavenging DPPH free radical of the pigment from pitaya peel

圖4 提取溫度對火龍果果皮色素提取液DPPH·清除率的影響Fig.4 Effect of extracting temperature on scavenging DPPH free radical of the pigment from pitaya peel

2.1.5 正交實驗結果 在單因素實驗的基礎上，確定影響火龍果果皮色素提取的3個因素3個水平(見表1)，采用L9(34)表用進行正交實驗，結果見表2。

表2 正交實驗結果Table2 The results of orthogonal experiment

由表2可得出，各因素對火龍果果皮色素提取液對DPPH·自由基的清除作用的影響主次順序依次為溫度＞提取時間＞料液比。最佳水平組合為A1B3C3，即采用提取溶劑為90%乙醇，提取溫度為25℃，提取時間為 180min，料液比為 1∶16(g/mL)，在此條件下對DPPH自由基的清除率可達94.68%。

由表3方差分析可知，在火龍果果皮色素提取工藝正交實驗所選擇的因素和水平范圍內，A、B、C因素的影響均未達到顯著性水平(p＜0.05)，即提取溫度、時間和料液比對火龍果果皮色素的DPPH·清除作用的影響均不顯著，而F值結果表明方差分析結果與直觀分析結果一致。

表3 正交實驗結果方差分析Table3 Analysis of variance on the result of orthogonal experiment

對正交實驗結果進行三次平行實驗驗證，結果表明采用提取溶劑為90%乙醇，提取溫度為35℃，提取時間為120min，料液比為1∶16的實驗條件，提取的火龍果果皮色素對DPPH自由基的清除率可達94.43%±0.24%。這與正交結果基本一致。

2.2 火龍果果皮色素的抗氧化性實驗結果

2.2.1 對DPPH·的清除結果 DPPH·在有機溶劑中是一種穩定的自由基，溶液在波長517nm處有特征吸收峰，呈紫紅色。自由基清除劑可與其單電子配對而使其吸收減弱，減弱程度與其所接受的電子數成定量關系，因此可用分光光度法評價火龍果皮色素提取液對自由基的清除情況。由圖5結果表明，火龍果皮色素提取液對DPPH·的清除作用比較大，結果呈對數關系，隨著火龍果皮色素提取液的濃度的增大，DPPH·的清除率越大，其關系式為y=26.071Ln(x)+30.736，相關系數R2=0.9965，火龍果果皮色素提取液清除50%DPPH·的有效濃度分別為 2.09mg/mL。當樣品濃度為 14.29mg/mL時，DPPH·的清除率達到100%。其關系表明在很低的樣品百分比下都可以顯示出較高的清除率。

2.2.2 羥自由基的清除結果 H2O2－Fe2+體系可通過Fenton反應產生自由基，鄰二氮菲－Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲－Fe3+后，其536nm最大吸收峰消失，建立以A536變化反映羥自由基氧化作用的比色測定法，可評價火龍果皮色素提取液對羥自由基(·OH)的清除能力。由圖6可知，火龍果皮色素提取液對羥自由基的清除作用呈正相關，其關系為:y=1.7602x－31.008，相關系數 R2=0.9937，火龍果果皮色素提取液清除50%·OH的有效濃度分別為46.02mg/mL左右。當樣品濃度為74.43mg/mL時，對羥自由基的清除率可以達到100%，顯示了火龍果果皮色素提取液對羥自由基有很大的清除作用。

圖5 火龍果果皮色素對DPPH自由基(DPPH·)清除能力Fig.5 DPPH free radical(DPPH·)scavenging capacity of the pigment from pitaya peel

2.2.3 對超氧陰離子自由基的清除結果 超氧自由基是機體代謝過程中產生的。實驗發現火龍果皮色素對超氧陰離子自由基生成均具有一定的清除作用。其清除作用的實驗結果見圖7，由圖7可知，火龍果果皮的色素提取液對超氧陰離子的清除作用呈正相關，在低百分比的濃度范圍內的關系為 y=20.481x+0.034，火龍果果皮色素提取液清除50%·的有效濃度分別為2.44mg/mL，在色素提取液濃度4.88mg/mL左右就可百分百清除超氧陰離子，顯示出了火龍果皮的色素提取液的超強的清除超氧陰離子的能力。

圖7 火龍果果皮色素對超氧陰離子的清除能力Fig.7 Superoxide anion radical scavenging capacity of the pigment from pitaya peel

由以上抗氧化實驗結果表明，火龍果果皮色素具有一定的抗氧化活性，但在不同的體系當中，其活性大小有所差別。由于實驗室條件有限，本實驗得到的火龍果果皮色素屬粗色素，如果要準備評價其中的具體色素的抗氧化性能，還需要進一步的分離純化。目前研究表明，色素具有一定的抗氧化活性［14］。本實驗得到的醇溶性粗色素可能包括花青素等多酚類色素和其他黃酮類色素。

3 結論

3.1 采用有機溶劑乙醇提取法提取火龍果果皮色素，利用正交設計實驗優化其提取工藝，最佳工藝參數:提取溶劑為90%乙醇，提取溫度為25℃，提取時間為180min，料液比為1∶16(g/mL)，在此條件下對DPPH自由基的清除率可達94.68%。

3.2 采用體外模型從羥自由基(·OH)的清除能力，DPPH自由基(DPPH·)的清除能力和超氧陰離子清除能力三個角度評價其抗氧化活性。研究結果表明，火龍果果皮色素清除50%DPPH·、·OH與·的有效濃度分別為2.09、46.0、2.44mg/mL。火龍果皮色素提取液對DPPH自由基的清除作用在一定的范圍內呈對數遞增;對超氧自由基的清除作用和羥基自由基的清除作用與其濃度呈正相關。

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