高粱抗絲黑穗病遺傳與分子育種

張春來，楊慧勇，柳青山，王花云，趙威軍，張福耀，董良利

（山西省農業科學院高粱研究所，山西省高粱工程技術研究中心，山西晉中030600）

高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）屬于單子葉植物綱禾本科高粱屬，是一年生高大草本植物，表皮覆蓋蠟質，具典型的C4植物特化光合作用器官、高光合效率功能和高產潛力，喜溫、抗旱、耐澇、耐瘠薄和耐鹽堿性，種植面積在世界糧食作物中占第5位（前4位依次為玉米、小麥、水稻、大麥），主要分布在非洲、亞洲、美洲的干旱和半干旱地區。高粱籽粒多作飼料和食用，也較多用于釀造；其莖稈除作燃料外，也用作建材和造紙原料。高粱的其他栽培類型還有飼草高粱、能源甜高粱和帚用高粱。

一般認為，高粱起源于非洲。我國有5 000 a以上的高粱栽培歷史，也是重要的起源和擴散地。全國高粱栽培區分為東北春播早熟區、華北春播晚熟區、華東春夏兼播區和西南等南方區。2004年高粱種植面積78.5萬hm2，總產量311.3萬t；2008年種植面積48.9萬hm2，總產量183.7萬t。發展和穩定高粱生產，對我國農業及相關產業發展尤為重要。

絲黑穗病是遍布全世界的重要高粱病害，是影響我國高粱生產發展的主要病害之一。其在東北、華北和西南高粱產區每年都有發生，發病率一般為3%～5%，嚴重的可達10%～40%，有時高達70%，給生產造成很大損失，是造成近年來高粱產量不高和不穩的主要因素[1]。實踐證明，應用抗病品種是控制該病的最有效途徑，但是，由于病菌與抗源的協同進化，不斷產生新的致病性強的生理小種，導致原有品種喪失抗性?？共∮N需要擁有較多的抗病種質和有效的種質篩選鑒定方法，也需掌握病菌生理小種變化趨勢，明確抗病種質的抗病機制和抗病性基因遺傳，才能對改良群體后代進行準確的選擇。

1 高粱絲黑穗病、病原菌及其生理分化

引起高粱絲黑穗病的病原菌為絲軸黑粉菌（Sporisorium reilianum（Kühn）Langdon et Full，別名 Sphacelotheca reiliana（Kühn）Clint.），屬擔子菌綱黑粉菌目黑粉菌科。該菌是以土壤傳播為主，主要侵染源為散落于土壤或糞肥內的絲軸黑粉菌冬孢子。冬孢子萌發后以雙核菌絲侵入高粱幼芽，從種子萌發至芽長1.5 cm期間為其最適侵染期。侵入的菌絲初期在生長錐下部組織中，40 d后進入內部，60 d后進入分化的花芽中。因此，該病是系統侵染病害。土壤溫度及含水量與發病密切相關，在土溫28℃和土壤含水量15%時發病率最高。春播時，土壤溫度偏低或覆土過厚，幼苗出土緩慢易發病。連作地發病較重。

病株在生長早期癥狀不明顯，但病株矮于健株。發病初期病穗穗苞很緊，下部膨大，旗葉直挺，剝開可見內生白色棒狀物，即烏米。苞葉里的烏米初期小、指狀，逐漸長大，后中部膨大為圓柱狀，較堅硬。烏米在發育進程中，內部組織由白變黑，后開裂，烏米從苞葉內外伸，表面被覆的白膜也破裂開來，露出黑色絲狀物及黑粉，即殘存的花序維管束組織和病菌冬孢子。葉片染病在葉片上形成紅紫色條狀斑，擴展后呈長梭形條斑，后期條斑中部破裂，病斑上產生黑色孢子堆，孢子量不大。散落在土壤中的病菌能存活1 a，冬孢子深埋土內可存活3 a。

國內外許多研究表明，高粱絲黑穗病菌有明顯的生理分化現象，存在不同的生理小種。美國早期報導有4個生理小種，近來還出現了新菌株[2]。Herrera等[3]指出，墨西哥有3個絲黑穗病菌生理小種。吳新蘭等[4]報道了我國的2個生理小種：1號小種對中國高粱和甜玉米致病力強，對甜高粱蘇馬克致病力弱，對白卡佛爾和Tx3197A幾乎不侵染；2號小種對Tx3197A、白卡佛爾和甜高粱蘇馬克致病力強，而對中國高粱和甜玉米致病力弱。徐秀德等[5]在遼寧省營口等地發現第3個生理小種，該小種能侵染1，2號小種不侵染的Tx622A和Tx622B（選為鑒別寄主），具有很強的致病力，并證明中國生理小種與美國生理小種相比具有完全不同的毒力特征。張福耀等[6-7]報道了在山西省高平發現的新生理小種，該小種對A2V4、晉雜12號有較強的致病力，而對3號小種致病的7501B，Tx7078，B35不能侵染，定名為4號生理小種。

徐秀德等[8]應用隨機引物對不同地理來源、不同寄主和經寄主致病力測定的高粱絲黑穗病菌2，3號生理小種的10個菌株的DNA進行分析，所產生的RAPD結果表明，S.reilianum具有豐富的種內遺傳多樣性,存在明顯的分化現象。經聚類分析，可將供試菌株大致分成2組，遼寧清原H2和黑龍江綏化H9菌株為一組，遼寧沈陽（H3）、阜新（H1）、營口（H10）、山西榆次（H4）、吉林四平（H5）、黑龍江哈爾濱（H6）、河北張家口（H8）等高粱絲黑穗病菌株以及遼寧沈陽的玉米絲黑穗病菌株（H7）為另一組，并且同一組內的DNA多態性亦有差異。因此，高粱絲黑穗病菌2號生理小種和3號小種間在分子水平上存在明顯差異。Prom等[9]用AFLP法對高粱和玉米的S.reilianum分離物進行了分子分析，包括44個美國德州、2個烏干達、1個馬里的高粱分離物和2個墨西哥玉米分離物，發現玉米和高粱分離物有很大非相似性（50%），聚類分析可將82%的高粱分離物劃分為4組，除了2個德州6號小種外，對基因漂流無地理或其他限制。

真菌致病因子有MAP激酶、鈣依磷酸酶B（calcineuin B）和 cyclophilin等。Schirawski等[10]研究結果顯示，寄生性病原菌如玉米絲軸黑粉菌和黑粉菌（Ustilago maydis）可通過分泌效應子蛋白（SEP）與寄主建立親密關系。對上述真菌的基因組測序發現，許多編碼SEP的基因具保守性，呈線性關系。SEPs分泌在寄主胞質中，在病原菌成功侵入并建立寄生關系時，會抑制寄主的免疫反應。由于SEP與寄主蛋白作用，會快速進化。在S.reilianum上找到43個低保守區，主要編碼SEP和以前鑒定出的毒力基因簇，進一步通過缺失突變顯示了4個未知多樣性區與毒力功能相關。該研究突顯了比較基因組學在鑒定近緣種致病毒力因子上的優越性。

2 抗絲黑穗病種質資源鑒定與抗性機制

抗絲黑穗病種質鑒定的常用接種法為土壤接種和種子接種，徐秀德等[11]在我國首創采用寄主皮下組織注射接種技術鑒定抗病高粱資源。Prom等[9]報道了針管注射和放置培養基接種法。徐秀德等[11]用高粱絲黑穗病菌2，3號生理小種，采用上述3種接種法對75份中外高世代材料進行同步抗性評價，明確了7050A/B，Tx378A/B，TNS30，SA281，蓮塘矮，GW4386，GW4388 等 38 份高粱育種試材在不同接種方法下對高粱絲黑穗病菌2，3號小種均表現免疫，是具有對高粱絲黑穗病多抗性的育種試材。柳青山等[12]采用土壤接種法也篩選到較多抗性種質?？共∮N主要采用雜交與回交相結合，將抗病基因導入需改良的品系中[1，12-13]。目前，生產上抗絲黑穗病的雜交種有：黑雜34、黑雜 46、齊雜 1號、晉雜 22號、晉雜26號、晉雜102號、晉糯2號、冀雜1號、遼雜10號、遼雜11號、遼雜12號、遼飼雜2號等?？共∮H本有：A_2Sx3197（13），46038，Tx-437，LRB204，SPL132A/B（421A/B），7050A/B，黑龍 14A/B，715 2A/B，吉農105A/B等。

對絲黑穗病菌抗性機制在玉米上報道較多。李興紅等[14]研究表明，冬孢子在感病的玉米材料胚芽鞘上的萌發率（13.2%～18.8%）顯著高于在抗病的玉米材料胚芽鞘上的萌發率（6.6%～7.1%）；感病幼苗中維生素C（Vc）和總糖的含量，顯著高于抗病材料，且二者與冬孢子在胚芽鞘上的萌發率呈顯著的正相關（r＝0.85，0.86），揭示了玉米幼苗期抗侵入的固有抗性；受玉米絲黑穗病菌侵染后，幼苗胚芽鞘內表皮在0.53 mol/L高滲蔗糖溶液中感病材料喪失質壁分離能力的細胞百分率高干抗病材料。賀字典等[15]研究表明，玉米對絲黑穗病菌的抗性與胚根和胚芽內的N，P，K含量呈正相關，與Vc和可溶性糖含量呈負相關。當病菌侵入后抗病品種苯丙氨酸解氨酶（PAL）和過氧化物酶（POD）活性上升幅度高于感病品種，而多酚氧化酶（PPO）、酯酶（EST）和超氧化物歧化酶（SOD）在感病品種中上升幅度高。倪深等[16]采用絲軸黑粉菌基因組的特異引物和PCR技術，分別對幼苗期的根、葉和成熟期的根、莖、葉、雄穗生長錐DNA進行PCR擴增，結果表明，特異引物的PCR技術不僅能夠在早期準確鑒定玉米幼苗是否受到病菌的侵染，而且可以跟蹤絲軸黑粉菌在體內擴展進程，認為玉米對絲黑穗病的抗性差異主要表現為抗侵染和抗擴展，抽穗期雄穗對病癭的形成不能表現出明顯的抗性效應。對高粱絲黑穗病抗性機制的研究較少。劉旭[17]研究表明，高粱苗期抗性品種葉片內SOD和POD活性、可溶性糖含量顯著高于感性品種，PPO，PAL，細胞壁酶PG活性無明顯差異；分蘗期抗性品種PG，PAL活性顯著高于感性品種，而SOD，POD，PPO，PG活性以及可溶性糖含量均無明顯差異。

3 抗絲黑穗病遺傳與抗病基因的分子標記

曹如槐等[18]1981—1985年用人工接種1號小種，按照不完全雙列雜交設計對17個抗性不同的品種（系）進行了對絲黑穗病的抗性遺傳研究，結果表明，高粱對絲黑穗病的抗性遺傳方式因品種而異，有的品種（系）具數量性狀遺傳特點，有的則具有質量性狀遺傳特點，抗病性屬數量性狀遺傳的品種（系），其抗性主要是受加性基因控制。楊曉光等[19]研究指出，高粱對2號小種的抗病性受2對非等位基因控制，且存在功能上的差異，雙親之一抗病，雜種1代未必都抗病，只有純合顯性基因控制的抗原，其F1的抗性才可靠。高粱對3號小種的抗病性受2～3對非等位基因控制，且基因間存在互作效應，還可能有修飾基因參與。徐秀德等[20]在人工接種條件下，用6個抗性不同的高粱種質，按照不完全雙列雜交設計，進行了高粱對絲黑穗病菌3號小種的抗性遺傳研究，結果表明，多數試材的抗、感性遺傳受質量性狀控制，只要親本之一為免疫，則F1表現免疫或高抗，可能是1～2對非等位主效基因的作用，還有微效基因的加性效應。鄒劍秋等[21]的抗性遺傳結果與此相近。

常規育種的表型選擇易受環境和人為因素影響，降低了選擇的準確性和速效性。為了提高抗病性選擇效率，早期進行分子檢測，需要對抗病性數量位點（QTL）進行定位和作圖，建立與其緊密連鎖的AFLP，SSR和SNP等分子標記，進一步精細作圖也可最終將抗病基因克隆。鄒劍秋等[21]采用SSR技術，應用分離群體分組分析法，分別利用恢復系分離群體（2381R/矮四）和保持系分離群體（Tx622B/7050B），篩選抗絲黑穗病3號生理小種基因的分子標記，得到了2個在抗病品系中穩定出現、可作為高粱抗絲黑穗病3號生理小種基因標記應用的SSR標記，即Xtxp13和Xtxp145，其分別位于第2號染色體和第9號染色體上，距離抗病位點的遺傳圖距分別約為9.6，10.4 cM，認為高粱對絲黑穗病菌3號生理小種的抗性可能受2對彼此獨立的非等位基因控制，并且基因之間存在著互作效應；篩選SSR標記時發現，高粱抗絲黑穗病基因的分子標記較易在保持系群體中找到，在恢復系群體中DNA片段多態性較少，表明恢復系和保持系在抗性機制上可能存在差異。Oh等[22]以SC325×RTx7078雜交的F2和F3材料，用RFLP和RAPD技術，對美國高粱絲軸黑粉菌5號小種的抗性位點Shs1進行分子標記，發現它與RFLP位點pSbTXS560和pSbTXS1294，RAPD位點OPG5連鎖，定位于第8染色體94.1 cM處。目前，我們正在應用SSR和SNP分子標記體系對4號小種的抗性位點進行定位和作圖，以便更準確地對抗病基因型進行選擇。

4 抗病基因分子生物學與轉基因技術培育抗病種質

轉基因技術已成為重要的育種工具，培育的轉基因棉花、大豆、甜菜、玉米和水稻品種已用于生產。最有效的轉基因方法為農桿菌介導轉化法，其次為基因槍微粒子射擊法。常用的目的基因有病程相關蛋白、類NBS-LRR抗病基因、抗病信號傳導基因和有關WRKY轉錄因子等。應用分子生物學技術研究植物與病原菌關系，在擬南芥、煙草和水稻等作物抗病反應信號傳導上，建立了水楊酸（SA）途徑、茉莉醛（JA）途徑和乙烯（ETH）途徑[23]。一般SA途徑抗寄生性病原（如絲黑穗病）、JA途徑和ETH途徑抗腐生性病原和蚜蟲等。我們用BLAST法搜尋高粱基因組抗病相關基因的結果如表1所示。

表1 BLAST搜尋高粱基因組抗病反應信號傳導基因的結果

Paterson等[24]在進行高粱基因組測序時已發現有211個NBS-LRR抗病基因，主要為CC-型，在5號染色體上最多（62個），僅Sb02g005860和Sb02g036630含TIR結構域，但都不含NBS結構域。Cheng等[25]鑒定出274個NBS基因，其中50個為非典型的NBS基因，劃分為CNL，CN，CNLX，CNX，CNXL，CXN，NX，N，NL 和 NLX 共10種類型。NBS基因在染色體上成簇分布，系在進化過程中過度復制形成。在這些NBS基因中很可能存在抗絲黑穗病的基因。

Zuther等[26]在比較受高粱?；蚐.reilianum f.sp.reilianum和玉米專化型S.reilianum f.sp.Zeae侵染高粱時，發現植保素luteolinidin的合成與抗病性相關，luteolinidin可延緩S.reilianum這2個?；偷臓I養生長，受病菌誘導表達的高粱基因SbDFR3（Sb04g004290）控制該途徑。Zhang等[27]對玉米絲黑穗病菌侵染抗感病材料根部早期進行了數字化基因表達分析，觀察到病程相關蛋白、GST活性、活性氧種類和木質素合成上的變化。Wang等[28]用Illumina MaizeSNP50基因芯片對144個近交系進行了全基因組關聯分析（GWAS），找到18個新的抗絲黑穗病基因，它們屬于抗病基因、抗病信號傳導基因和其他具抗病功能的基因。左為亮等[29]定位了玉米高抗絲黑穗病親本吉1037和高感親本黃早四的BC1F1群體的一個主效QTL-qHSR1，它位于第2號染色體bin2.09的位置，能夠解釋表型變異率36%。使用回交群體和基于重組后代的連續精細定位方法將主效QTL-qHSR定位于分子標記STS1M3和STS3M1之間。通過對篩選得到的黃早四和Mo17的BAC克隆進行測序，發現定位的qHSR1區域在Mo17中為152 kb，而黃早四中的相應區段僅為5 kb，缺失的片段大小達147 kb。通過對Mo17的這一區段進行基因預測，發現了一個編碼細胞壁相關的激酶（WAK）的基因ZmWAK，推測為qHSR1候選基因。WAK激酶是一個受體類蛋白，主要定位在細胞膜上。ZmWAK主要在吉1037的根、莖、葉中表達，其中以10 d幼苗期的莖中表達量最高，并且在接種絲軸黑粉菌后表達量上升。含ZmWAK的轉基因后代植株與對照相比，抗病率明顯上升13%～20%。通過對來自世界各地的520份自交系進行分析，發現ZmWAK基因的缺失在自交系中是一種普遍現象，約占總數的20%。對其中的49份國內材料進行性狀鑒定，發現在34份抗病材料中，總共有32份材料帶有ZmWAK基因；而在15份感病的自交系中，有7份自交系在這個基因上發生缺失，表明ZmWAK基因可能在玉米對絲黑穗病的抗病途徑中起重要作用。

甘蔗粒黑粉病菌（Sporisorium scitaminean）和鞭黑粉菌（Ustilago scitaminean）是高粱絲軸黑粉菌S.reilianum的近緣種。LaO等[30]用cDNAAFLP研究了甘蔗與S.scitaminean作用時基因差異表達，在所得的64個轉錄片段中，67%的抗病品種發生上調，包括氧猝發、防御反應、木質素合成、乙烯和生長素途徑。Que等[31]用雙向等電聚焦電泳（2-DE）和MALDI-TOF-TOF/MS研究了受S.scitaminean誘導的甘蔗蛋白，得到23個蛋白，其中20個與信號轉導、抗病和光合有關。吳期濱等[32]應用Solexa高通量測序技術研究了高抗黑穗病的含有斑茅血緣的甘蔗無性系Ya05-179響應U.scitaminean侵染的表達譜分析與差異表達基因鑒定，在比較分析甘蔗黑穗病菌脅迫前后甘蔗幼芽RNA表達譜的基礎上，獲得2015條差異表達序列標簽（ESTs），其中上調表達與下調表達各有1 125條和890條，進一步先從中篩選出差異表達倍數大于5的31條上調表達和17條下調表達的ESTs及MAPK信號級聯傳導途徑中3條上調表達EST；作為探針種子序列進行電子克隆，獲得了20條具有完整開放閱讀框（ORF）的甘蔗差異表達基因cDNA全長序列，其中16條上調和4條下調表達，包括MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號級聯傳導途徑中3個上調表達的基因BAK 1，Mapkk和Glo 1，及GT-3b，MYB和h/ACA共3個轉錄因子基因14個預測蛋白新基因。用RT-PCR技術，對BAK 1，Mapkk和Glo 1這3個基因進行克隆，獲得3個基因的cDNA全長序列，上述基因推導的氨基酸序列的同源性比對和系統進化樹分析顯示，甘蔗BAK 1基因與高粱、Mapkk和Glo 1基因與玉米的相應基因同源性較高，分別達99%，97%和99%；用qRT-PCR技術顯示，病原脅迫后0～12 h，抗、感病基因型中3個基因的表達量均上揚，且抗病基因型上揚幅度較大，推斷這3個基因的表達在甘蔗抵御病原菌的侵染以及侵染后最初病程中起重要作用，且基因的表達與抗病性相關，但Glo 1在脅迫48 h后表達再次上揚，推斷它在抗病中的作用機制與BAK 1和Mapkk基因存在一定的差異。該研究基于Solexa表達譜測序分析，挖掘甘蔗響應黑穗病菌侵染的差異表達基因，為進一步了解甘蔗對黑穗病的抗性機制奠定了基礎，也對高粱抗絲黑穗病研究有所啟發。

目前，基于農桿菌介導轉化法和基因槍微粒子射擊法在高粱上都有成功報道，但相關參數仍待進一步優化。石太淵等[33]用花粉管通道法將無毒廣譜抗病基因PYH157導入高粱，獲得了轉基因植株；應用聚丙烯酰胺等電聚凝膠電泳蛋白質分析表明，PYH157已被整合到高粱基因組中并能表達，田間接種絲黑穗病試驗中篩選出4個較抗病的轉基因植株。杜建中等[34]報道了以幾丁質酶基因轉化抗絲黑穗病玉米的選育，以轉基因導入玉米自交系海92-1所獲得的轉基因植株的種子作為試驗材料，對T1，T2和T3株系的PCR檢測結果說明，目的基因在轉基因植株中可穩定遺傳；田間抗病鑒定結果顯示，轉基因株系的發病率比當代對照株系明顯減少2～4級，選育得到的純合系06006和06012的發病率為0，表現出高抗病性。Allen等[35]將Toti-病毒抗真菌蛋白KP41在轉基因玉米中系統表達，莖部和穗部接種抗黑粉病鑒定表明，轉基因后代高抗U.maydis。

綜上所述，應用轉基因技術培育抗絲黑穗病的高粱研究還較少，但具抗絲黑穗病潛力的候選基因比較多，基因組學、轉錄組學和蛋白組學研究將會開發出更多的有用基因，當務之急是選擇上述具幾種抗病機制的基因，創制轉基因植株，盡早選育出具有持久抗病性的轉基因品種。

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