去壁低滲法制備無(wú)融合生殖甜菜M14 染色體標(biāo)本

劉麗萍 ，王 艷

(黑龍江大學(xué)a.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心;b.黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;c.農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150080)

0 引 言

為了探明無(wú)融合生殖甜菜單體附加系M14 品系高頻傳遞的原因和機(jī)理，本文在壓片法及子房透明技術(shù)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用去壁低滲法制備無(wú)融合生殖甜菜單體附加系M14 的染色體標(biāo)本，提高了對(duì)附加的1 條白花甜菜染色體的識(shí)別效率。

去壁、低滲法是陳瑞陽(yáng)對(duì)中國(guó)果樹(shù)及野生近緣植物染色體標(biāo)本的研究改良技術(shù)，對(duì)栽培植物的遺傳育種以及對(duì)世界栽培植物的起源與演化都起著重要的理論和指導(dǎo)意義。植物染色體研究在三、四十年代起過(guò)先驅(qū)作用，但50 年代后與動(dòng)物染色體研究相比發(fā)展緩慢［1］。近年來(lái)，由于染色體技術(shù)的不斷發(fā)明和完善，使涉及以染色體為基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、染色體工程學(xué)等領(lǐng)域都取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展［2-5］。

無(wú)融合生殖是指不經(jīng)過(guò)雌雄配子融合而產(chǎn)生種子的一種特殊生殖方式，能使基因型的雜合性得以保持，從而固定雜種優(yōu)勢(shì)，對(duì)作物育種具有重要的意義［6-9］。我院無(wú)融合生殖甜菜研究于1988 年開(kāi)始進(jìn)行栽培甜菜與野生白花甜菜的種間雜交工作。以栽培甜菜為母本，白花甜菜為父本進(jìn)行雜交，獲得真實(shí)雜種VC88-1(VVCC、2n=4χ=36)。利用栽培甜菜回交產(chǎn)生帶有白花甜菜的單體附加系，獲得了栽培甜菜附加一條白花甜菜第9 號(hào)染色體的M14 單體附加系系列［10-12］，從而將攜帶無(wú)融合生殖基因的一條白花甜菜染色體轉(zhuǎn)移到栽培甜菜。使原來(lái)只進(jìn)行有性生殖的栽培甜菜可以高效表達(dá)無(wú)融合生殖特性［13-14］，并可以通過(guò)母本95%以上高頻傳遞后代。經(jīng)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定［15］，發(fā)現(xiàn)甜菜單體附加系M14 具有有性生殖與二倍體孢子生殖特性，為兼性無(wú)融合生殖體［16］。甜菜課題組每年春天都以鏡檢的方式對(duì)染色體傳遞率進(jìn)行檢查并分析。鏡檢方法一直使用常規(guī)的壓片法［17］，其速度快潔、方法簡(jiǎn)便易行，即便如此，壓片法也只是停留在染色體計(jì)數(shù)水平。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用去壁低滲法通過(guò)熒光顯微技術(shù)可以快速找到附加的一條白花甜菜第九號(hào)染色體，它常常游離于栽培甜菜染色體之外，使本來(lái)難以分辨的那條附加的白花甜菜染色體更加易于識(shí)別與分離。為無(wú)融合生殖甜菜的染色體微分離、微克隆、Fish 熒光原位雜交等提供了前提條件和技術(shù)保障。

1 實(shí)驗(yàn)器材及試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

顯微鏡(具有照相設(shè)備);培養(yǎng)箱(室溫至60 ℃);蒸餾水重蒸設(shè)備;冰箱(0 ℃);超凈臺(tái);載玻片;眼科鑷子;保安刀片;磨口三角瓶(50 ～100 mL);移液管(10～20 mL);移液器;燒杯(50、100 mL);試劑瓶(125、250、500 mL);刻度滴管(1、2 mL);酒精燈;普通玻璃板20 cm×20 cm;牙簽;5 mL 青霉素瓶。

1.2 試 劑

Giemsa 母液配制。0.5 g Giemsa 粉加33 mL 優(yōu)質(zhì)丙三醇于研缽中，充分研磨1 h→放入56 ℃溫箱2 h，再加入33 mL 甲醇(GR)混勻裝瓶備用(儲(chǔ)存的時(shí)間越長(zhǎng)越好)。

Giemsa 染色液。100 mL 磷酸緩沖液加入3 ～5 mL Giemsa 母液(用前現(xiàn)配)。

磷酸緩沖液。A 液［0.067 mol/L 磷酸二氫鉀］:稱磷酸二氫鉀49.118 g 加蒸餾水定溶至1 000 mL;B液［0.067 mol/L 磷酸氫二鈉］:稱磷酸氫二鈉9.467 g加蒸餾水定溶至1 000 mL。

混合酶液。纖維素酶、果膠酶各0. 5 g，加入20 mL 無(wú)菌水即為2.5%的混合酶液(冰箱保存，不宜過(guò)久)。實(shí)驗(yàn)材料與酶液的體積比控制在1 ∶20 ～1 ∶50。酶解的材料經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次并浸泡30 min，除掉固定液。酶解時(shí)間:0.5 ～2.0 h。

前低滲。用滴管吸去處理液，直接換入0. 075 mol/L 氯化鉀溶液致使細(xì)胞膨大，然后滴片。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

無(wú)融合生殖甜菜M14(2n =18 +1，附加一條白花甜菜第9 號(hào)染色體)。取室內(nèi)培養(yǎng)的根尖做試材。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 根尖培養(yǎng)及固定

將甜菜種子用70%乙醇浸泡1 ～2 min→0.001 L汞浸泡10 min→用無(wú)菌水洗3 ～4 次→在無(wú)菌水中浸泡24 h 后，將種子平鋪于培養(yǎng)皿中，蓋上一層紗布，于25 ℃溫箱中培養(yǎng)。每天早晚更換2 次水。試驗(yàn)材料可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)隨時(shí)培養(yǎng)。取樣部位根尖分生區(qū)。甜菜根尖小，切取根尖1 ～2 mm 長(zhǎng)進(jìn)行預(yù)處理，用0.2 mmol/L 8-羥基喹啉處理2 ～4 h，蒸餾水洗2 次。經(jīng)前低滲的材料，用甲醇∶冰醋酸(3 ∶1)的卡諾固定液固定，固定時(shí)間如果超過(guò)4 h，可將材料轉(zhuǎn)入70%酒精中長(zhǎng)期保存。

2.2.2 涂片法和滴片法制備染色體標(biāo)本

將預(yù)處理過(guò)2 h 的實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行前低滲(0.075 mol/L KCl 溶液)使細(xì)胞膨大，用2.5%混合酶液酶解0.5 ～2 h，去掉細(xì)胞壁，再進(jìn)行后低滲，后低滲液用重蒸水將實(shí)驗(yàn)材料反復(fù)處理2 ～3 次。

涂片:將處理好的材料用3 ∶1 的卡諾固定液固定20 ～30 min 后涂片，火焰干燥后用已經(jīng)配制好的Giemsa 染色液染色，鏡檢觀察。

滴片:將后低滲的材料制備成細(xì)胞懸液:先用(3 ∶1)卡諾固定液固定→去沉淀，制成細(xì)胞懸液→去上清后再制成細(xì)胞懸液，用移液器將細(xì)胞打散，距離載玻片約0. 33 m 高度進(jìn)行垂直滴片，火焰干燥后用Giemsa 染色，鏡檢觀察。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

該技術(shù)操作程序簡(jiǎn)單、快速、省時(shí)，實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備室內(nèi)即可完成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明染色體分散效果良好，利用Olympus-BX51 型熒光顯微鏡可以清晰地觀察到無(wú)融合生殖甜菜分散效果良好的分裂相。實(shí)驗(yàn)材料:根尖的分裂相不如心葉多。

滴片法(見(jiàn)圖1)較凃片法(見(jiàn)圖2)觀察到的視野更加清爽、干凈。從圖1 能觀察到染色體自然裸露的雜合狀態(tài)——附加的一條白花甜菜染色體游離于栽培甜菜18 條染色體之外，更加易于識(shí)別分辨與分離。

圖1 溶片法制備染色體標(biāo)本 圖2 涂片法制備染色體標(biāo)本

4 結(jié) 語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須注意的是:清潔無(wú)污染，制片在無(wú)菌操作室進(jìn)行，以便對(duì)染色體進(jìn)行后續(xù)操作。載玻片清洗滅菌消毒后置于載片盒內(nèi)存放于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｏ裙潭ê竺附猓蟮蜐B時(shí)間要充足，甜菜組織經(jīng)過(guò)低滲之后，細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的浸泡會(huì)吸水膨脹使細(xì)胞更加充盈飽滿，滴片時(shí)要注意高度垂直、有力度，使細(xì)胞滴落到載片后染色體達(dá)到自然散開(kāi)的狀態(tài)。另外實(shí)驗(yàn)材料與酶液的體積比要控制在1 ∶20 ～1 ∶50 之間。如需長(zhǎng)期保存可用丁香油封片。本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)o(wú)融合生殖甜菜染色體進(jìn)行后續(xù)分離及Fish 熒光原位雜交，對(duì)無(wú)融合生殖甜菜的深入研究具有重要意義。

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