響應面法對牛喉管軟骨多糖提取的工藝優化

陳宏碩，王維君，李曉穎，宋雪梅

（1.河北聯合大學電氣工程學院，河北唐山 063009；2.天津市食品加工工程中心，天津 300457）

多糖種類繁多，來源廣泛，它們廣泛存在于動物、植物、微生物（細菌和真菌）和海藻中。它們又可分為胞外和胞內多糖，其中研究得比較多的是植物多糖和微生物多糖。而動物軟骨中除含有豐富的磷、鈣、微量元素外，還含有大量的膠原蛋白和酸性粘多糖。酸性粘多糖是構成動物結締組織的特有成分之一，植物中幾乎不含有。動物軟骨中起作用的主要是多糖物質，動物多糖主要由糖原、甲殼素、肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、硫酸肝素、透明質酸等復合而成[1]，本文主要針對牛喉管軟骨多糖的提取工藝條件進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛喉管軟骨、堿性蛋白酶、胰蛋白酶：均為天津市諾奧科技發展有限公司產品；硫酸軟骨素abc 酶：美國sigma 公司產品；乙醇、苯酚、硫酸、咔唑、硼砂、過硫酸胺、十二烷基磺酸鈉均為分析純；乙腈、甲醇均為色譜純。

1.2 主要儀器與設備

HW·SY21-K4 系列電熱恒溫水浴鍋：北京長風儀器廠；PHS.3C 型pH 計：上海嘉鵬科技有限公司；高效液相色譜（HPLC）儀：日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 多糖的提取工藝研究

工藝路線圖[3-6]：組織脫脂、脫鈣→加入水解酶（堿性蛋白酶，胰蛋白酶）雙酶進行酶解→酶解液除蛋白（三氯乙酸→3 倍體積醋酸鉀-乙醇混合液4 ℃沉淀過夜→8 000 轉離心30 min，得沉淀物Ⅰ→沉淀物用0.2 mol/L 的NaCl 液溶解8 000 轉離心30 min，取上清→加入0.5 mL 的十六烷基吡啶鹽（5%）→離心得沉淀Ⅱ，再用2.5 mol/L 的NaCl 鹽溶解→用5 倍體積的乙醇沉淀→10 000 r 離心30 min，得到多糖提取物。

按照下式計算多糖提取率：多糖提取率%=多糖的質量/提取前樣品質量×100%

1.3.2 酸性多糖含量測定

動物軟骨多糖中主要是含有酸性多糖，根據由Bitter 和Muir 改良的咔唑法（葡糖醛酸含量計）測定多糖含量。分別測定不同濃度葡萄糖醛酸標準溶液的吸光度，繪制標準曲線，并計算出吸光度和濃度的線性回歸方程。取樣品0.1 g/L 的溶液1 mL，按照標準曲線項下的方法測定吸光度，在標準曲線上查出相應的葡糖醛酸濃度，按下式計算酸性多糖含量：葡萄糖醛酸%=標準曲線查出的濃度/樣品濃度×100%

1.3.3 軟骨多糖的HPLC 分析

參照牛增元等[7-8]的方法進行分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

根據前期單因素試驗研究結果，確定溫度、pH、攪拌時間為影響多糖提取率的3 個關鍵因子，并且單因素實驗多糖提取率最大值為18.13%。因此，采用三因素四水平的響應面優化實驗來確定多糖提取率的條件。

2.2 響應面優化實驗結果

2.2.1 Box-Behnken 實驗設計

根據前期單因素試驗研究結果，表明溫度、pH、攪拌時間為影響多糖提取率的3 個關鍵因子。因此，采用Box-Behnken 模型，分別以X1、X2、X3來表示關鍵因子（自變量），+1、0、-1 代表其高、中、低水平。實驗設計與數據處理采用輔助軟件SAS 8.0 來完成。表1 列出了各自變量的實驗水平范圍及其編碼。采用多元回歸技術，擬合二次多項模型的Box-Behnken 設計見表1。

表1 Box-Behnke 實驗因素水平Table 1 Experimental variables and levels for Box-Behnke

依據Box-Behnke 中心組合實驗設計原理，以X1（溫度）、X2（pH）、X3（攪拌時間）為自變量，以多糖喉管骨多糖得提取率Y（mg/mg，%）為響應值，設計響應面分析試驗，Box-Behnke 實驗設計及結果見表2。

以多糖提取率為響應值，根據表2 中Box-Behnken 設計的實驗結果，利用SAS 軟件對其結果進行二次回歸分析，得回歸方程（predictivemodelforY1），對其回歸方程的方差分析見表3。

表2 Box-Behnke 實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnke

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis for regression equation

其中：Y1代表喉管骨的多糖提取率響應值。

從回歸方程的方差分析表3 中可以看出模型在α=0.01 水平上回歸顯著。模型可信度分析見表4，其中復相關系數的平方R2=0.954 1，說明模型可以解釋95.41%實驗所得多糖提取率的變化，表明方程擬合較好。CV（Y 的變異系數）表示實驗的精確度，CV 值越高，實驗的可靠性越低，本設計實驗中CV=2.146 1%，較低，說明實驗操作可信。綜上說明回歸方程給喉管骨多糖提取率提供了一個合適的模型。

2.2.2 響應面分析及最佳提取條件的確定

根據以上實驗結果，對模型的可信度分析見表4。

表4 模型的可信度分析Table 4 Fit statistics for model

通過回歸方程來繪制分析圖，以考察所擬合響應曲面的形狀，響應曲面立體分析見下圖1。

圖1 Y=f（X1，X2）響應面立體圖Fig.1 Y=f（X1，X2）Responsive surface plot

綜上所述，從圖中及軟件分析，回歸方程存在穩定點，穩定點是極大值點。通過嶺嵴分析（ridgeanalysis）得到極大值所對應的各主要因素（X1，X2，X3）的編碼值分別為：喉管骨（-0.158 85，0.520 82，-0.165 37），即溫度、pH、攪拌時間的最佳值分別為53.4 ℃、8.23、9.3 h，此時喉管骨多糖提取率可達20.19%。

2.2.3 實驗結果驗證

以2.2.2 確定的主要因素條件來提取多糖，喉管骨多糖提取率均值20.05%，與預測值20.19%是非常接近的；同時，與單因素實驗的最大提取率相比提高了10.59%。可見，應用響應面法優化提取條件可行，回歸模型較可靠。

2.3 牛喉管骨軟骨多糖中酸性多糖含量分析

取含0.1 g/L 樣品的溶液1 mL，按照1.3.2 方法測定吸光度，然后計算出多糖含量。單因素實驗中測定其中的酸性多糖含量最高34.94%，而提取條件優化后結果顯示喉管骨中酸性多糖含量為39.58%，酸性多糖含量相比提高了10.3%。

2.4 牛喉管軟骨多糖液相分析

喉管骨多糖樣品經處理后，通過高效液相色譜法得出喉管骨的液相色譜見圖2。

圖2 喉管骨軟骨多糖的液相色譜圖Fig.2 The liquid chromatogram of throat cartilage polysaccharides

從圖2 可以看出，喉管骨多糖的出峰位置是2.56 min，與標準品硫酸軟骨素出峰位置2.69 min 相比延遲了，原因可能與自身某種基團的結構有關。而且牛喉管軟骨多糖在主峰后面有一個小峰，可能是糖蛋白。

3 結論

1）通過單因素和響應面設計實驗最終確定軟骨多糖的最佳提取工藝條件，即溫度、pH、攪拌時間的最佳值分別為53.41 ℃、8.23、9.33 h；此條件下的多糖提取率是20.05%，酸性多糖含量達39.58%。

2）通過液相色譜分析，初步推斷出牛喉管軟骨多糖為類硫酸軟骨素多糖，說明優化工藝能夠保持牛喉管軟骨中的酸性多糖品質。

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