谷氨酰胺轉胺酶對豬血漿蛋白凝膠特性的影響

王芳，賈萬利，李會珍

（中北大學化工與環境學院，山西 太原 030051）

轉谷酰胺酶（Transglutaminase，TG）存在于動物、植物和微生物中，不同來源的酶都各有自己的性質，目前研究和應用最多的酶是來源于微生物輪枝鏈霉菌（Streptoverticillum mobaraense）的酶，這是目前唯一商業化的轉谷酰胺酶。微生物轉谷酰胺酶（MTG）是一種不依賴鈣的酶，此外，它對氨基酸殘基的專一性要求也比較低。因此與其他來源的轉谷酰胺酶相比，MTG 酶能與更多蛋白質的氨基酸殘基發生反應，而且MTG 酶形成的質構特性更優。MTG 酶能夠催化蛋白質中谷氨酰胺殘基與賴氨酸之間的?；D移反應，通過胺的導入、交聯形成共價鍵，從而形成蛋白質網絡結構，可在一定程度上改善蛋白質的結構和特性。近年來，有研究報道外源性谷氨酰胺轉氨酶能催化食品蛋白質交聯或谷氨酰胺轉氨酶介導蛋白質的聚合作用，從而改善相應蛋白質功能特性。研究的蛋白質種類包括牛奶酪蛋白、大豆蛋白、蛋清蛋白、豬肉肉糜、牛肉肉糜等，研究內容包括酶對食品基質的作用效果，以及酶對蛋白質底物的催化特性及機理[1-6]。

豬肉是我國居民消費量最多的一類肉，豬血產量可達到10.5 億kg[7]。豬血中含有至少100 種不同的蛋白質組分，其中血漿白蛋白占60%，血漿球蛋白占35%，血纖維蛋白占4%，很多都可以作為食品的功能性組分[8-9]。目前國內外對豬血的綜合利用，主要有制作飼用血粉、提取生化藥品，如血紅素、超氧化物歧化酶、蛋白胨等，此外還有很大一部分用于提取血漿蛋白并應用在食品中。工業化屠宰得到的血漿可用于肉品加工，如豬血漿還可以作為脂肪替代品應用在低脂肉制品中[10]。豬血在香腸中的應用則更為普遍[11]，其中血漿的作用是在熱誘導條件下形成凝膠，增強香腸的質構特性[12]。

豬血形成熱凝膠的能力和其乳化特性對食品加工是非常重要的[13]。能形成熱誘導凝膠的主要是血漿白蛋白，鈣以及凝血相關的酶能增強凝膠活性。有研究報道了豬血漿蛋白熱誘導凝膠質構特性及持水性因素的研究，認為血漿蛋白濃度、加熱時間、離子種類和pH 都對凝膠特性有影響[14]。對豬血漿蛋白凝膠性質的系統研究有利于其在食品中的應用[15]。本試驗主要探討微生物谷氨酰胺轉氨酶的添加及作用條件對豬血漿蛋白凝膠質構特性及持水性的影響，以期找到MTG 酶對豬血凝膠的作用規律，找到最佳的酶處理方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微生物谷氨酰胺轉胺酶（MTG 酶）：酶活性為100 U/g，日本味之素株式會社；檸檬酸三鈉（分析純）。

1.2 儀器與設備

TA-XPLUS 質構儀：英國Stable Micro System 公司；SD-1000 Spray Dryer：日本東京理化株式會社；ALC-210 型萬分之一電子天平：Acculab 公司；TDL-5C低速臺式大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；S20P SevenEasyTMPlus pH 酸度計。

1.3 方法

1.3.1 豬血漿蛋白粉的制備

收集新鮮豬血，添加8 g/100 mL 檸檬酸三鈉以防止凝血，在4 ℃以1 388 g 離心10 min，得到豬血漿蛋白。豬血漿蛋白以進風溫度240 ℃，出風溫度85 ℃進行噴霧干燥制得豬血漿蛋白粉。其水分含量為7.5%（質量分數），蛋白質含量為82%（質量分數）。

1.3.2 添加MTG 酶的豬血漿蛋白凝膠制備

表1 谷氨酰胺轉氨酶在豬血漿蛋白凝膠中的添加方式Table 1 Levels of transglutaminase addition in porcine blood plasma gel

1.3.3 豬血漿蛋白凝膠失水率測定

失水率測定前樣品提前從4 ℃冰箱中取出，于室溫放置30 min。凝膠柱（長14 mm，直徑8 mm）置于離心管（0.45 μm）中，以4 000 g 離心10 min，測定樣品損失的重量，每個樣品重復3 次，取平均值。失水率計算公式如下：

式中：M1為離心前凝膠柱質量；M2為離心后凝膠柱質量。

1.3.4 質構測定

質構測定前樣品提前從4 ℃冰箱中取出，于室溫放置30 min。樣品為直徑8 mm，長14 mm 的圓柱，應用TPA 程序測定硬度、彈性和內聚性。樣品用鋁圓柱探頭（直徑50 mm）下壓兩次，高度為初始高度的25%，前速度為60 mm/min，下壓至30 %變形，下壓速度為1 mm/s，回復時間為2 s，硬度、彈性、內聚性值由TPA曲線計算。每個樣品重復3 次取平均結果。數據結果采用最短顯著極差法（SSR 法）進行多重比較[16]。

2 結果與討論

2.1 MTG 酶添加量對豬血漿蛋白凝膠失水率的影響

MTG 酶添加量對豬血漿蛋白凝膠失水率的影響見圖1。從圖1 可以看出，與未添加MTG 酶的豬血漿蛋白凝膠失水率相比，MTG 酶處理組凝膠的失水率顯著降低（P＜0.05），說明MTG 酶的添加顯著提高了豬血蛋白凝膠的持水性。但是從酶濃度和保溫時間組合的6 個試驗組的結果來看，酶濃度和保溫時間對凝膠失水率的影響是相互依賴的，不存在單向促進或減少的作用趨勢。在保溫時間為30 min 的4 組處理中，隨著酶添加量增大，凝膠失水率減小，表明酶量的增加提高了凝膠的持水性。而在保溫60 min 的4 組處理中，酶量在0.6 g/100 mL 時凝膠的持水量達到最高，酶量的繼續增加對持水性沒有進一步的增強作用，反而有所降低。

圖1 MTG 酶添加量對豬血蛋白凝膠失水率的影響Fig.1 Effect of MTGase on water released of porcine plasma protein gels

如果MTG 酶添加量固定，在0～0.6 g/100 mL 的范圍內，40 ℃保溫時間越長，則凝膠失水率越小。血漿蛋白是賴氨酸的極好來源，酶處理可以使蛋白質分子間交聯，以及小肽分子間的交聯，形成堅試的空間結構，將水分子包容其中，從而減小豬血凝膠的失水率。然而，交聯率同時取決于賴氨酸和谷氨酸殘基的接觸概率。豬血漿蛋白中的蛋白質天然狀態多為球蛋白，由于其天然狀態下緊密的結構，MTG 酶不容易接近目標殘基，因而不容易催化發生交聯。因此在酶處理過程中保溫適當的時間非常重要，因為MTG 酶在催化蛋白質時，存在一個誘導蛋白質結構發生變化的過程，此時，較緊密的蛋白質球狀空間結構逐步展開，暴露出內部的疏水性氨基酸殘基，二級結構也發生改變[2]。蛋白質受酶的誘導及加熱變性部分展開結構后，則可以暴露更多的作用位點，增加酶的敏感性，更易于發生聚合反應。然而，保溫時間對于酶敏感性的影響并不是越長越好，增加酶添加量可以縮短保溫時間，反之亦然。在試驗條件下，酶添加量為0.6 g/100 mL 時40 ℃保溫60 min 豬血凝膠持水率最大，添加量0.9 g/100 mL時40 ℃保溫30 min 也可以達到相似的效果。以上結果說明保溫時間和酶添加量對持水性有協同作用，在試踐中可以根據試際需要調整酶用量和作用時間?？偟膩碇v，MTG 酶的添加，增強了豬血漿蛋白凝膠中蛋白質—水分的相互作用力，從而減少了失水率。這一特征在肉品加工中可以增加產品得率，對肉品加工企業有試際意義。

2.2 MTG 酶添加量對豬血漿蛋白凝膠硬度的影響

MTG 酶添加量對豬血漿蛋白凝膠硬度的影響見圖2。

圖2 MTG 酶添加量對豬血蛋白凝膠硬度的影響Fig.2 Effect of MTGase on hardness of porcine plasma protein gels

圖2 表明，添加谷氨酰胺轉氨酶后，血漿蛋白凝膠的硬度增大。統計分析表明，酶處理的豬血凝膠樣品總體上比對照組硬度顯著增加（P＜0.05）。酶添加量在0.6 g/100 mL 并且40 ℃保溫60 min 時凝膠硬度達到最大。這可能是谷氨酰胺轉氨酶的作用促進了蛋白分子之間的作用力，增加了凝膠硬度，然而添加酶的不同處理組之間硬度差異不顯著。值得注意的是，不添加MTG 酶單純加熱也可以提高豬血蛋白凝膠的硬度，血漿組分非常復雜，含有多種酶，熱處理可能涉及到蛋白質變性、聚集和凝膠的綜合反應，從而使凝膠硬度增加。此外，保溫時間也顯著影響凝膠硬度（P＜0.05），當保溫時間為60 min 時，豬血蛋白凝膠硬度普遍高于保溫30 min 組的硬度值。在本試驗中盡管沒有考慮更高的保溫時間，試驗室進行的預試驗包括保溫時間到120 min 表明，在同一個酶濃度水平，保溫60 min 就能達到最大硬度值，超過60 min 硬度沒有繼續增加。如果保溫時間一定，則在0～0.6 g/100 mL 的范圍內，隨著酶濃度的增加，凝膠硬度增加。超過0.6 g/100 mL，酶濃度的增加硬度反而有所下降。這說明MTG 酶添加量與保溫時間存在最佳組合，超過酶的最佳處理條件范圍，凝膠質構產生副作用。其原因可能是過量的交聯共價鍵將會抑制蛋白質網絡均一性的發展。

0.6g/100 mL 的酶濃度相當于4 U/g 豬血蛋白，與文獻中報道的值比較一致。文獻報道在牛肉凝膠中用到的MTG 酶濃度是1.4 U/g 牛肉蛋白[17]，3 U/g～6 U/g豬肉蛋白凝膠[18]，10 U/g 燕麥球蛋白[19]。用于交聯牛乳蛋白的量是20 U/g 牛乳蛋白[20]。

2.3 谷氨酰胺轉氨酶添加量對豬血凝膠彈性和內聚性的影響

谷氨酰胺轉氨酶添加量對豬血漿蛋白凝膠彈性和內聚性的影響見表2。

表2 谷氨酰胺轉氨酶添加量對豬血漿蛋白凝膠彈性和內聚性的影響Table 2 Effect of transglutaminase on springiness and cohesiveness of porcine blood plasma gelling

從表2 可以看出，添加MTG 酶能增加豬血凝膠的彈性，與不添加酶的對照組相比差異顯著（P＜0.05），而酶的添加對豬血凝膠的內聚性沒有顯著影響。在質量濃度0.3 g/100 mL～0.9 g/100 mL 的范圍內，不同的酶濃度對豬血凝膠彈性的影響差異不大。與對照組相比，不添加MTG 酶只進行40 ℃保溫的處理對豬血凝膠的彈性也有顯著影響（P＜0.05），說明加熱可以提高凝膠的彈性，但是40 ℃保溫60 min 的時間段內，不同的保溫時間對凝膠彈性沒有差異。

MTG 酶對豬血漿蛋白凝膠質構特性的影響效果有其微觀結構解釋，食品蛋白質的質構特征比如硬度、內聚力、彈性都可能通過改變自然交聯或者在蛋白結構中引入新的交聯來試現，因此MTG 酶的添加能夠起到蛋白質交聯的作用，從而改善凝膠質構.從目前結果來看，添加MTG 酶和加熱兩個條件都對凝膠的彈性產生影響，但對內聚性不產生顯著影響。對于凝膠內聚性的要求需要提供另外的條件進行研究。

3 結論

可以得出結論，血漿蛋白的凝膠特性可以通過添加MTG 酶并保溫來改善，尤其是能夠減少凝膠失水率。最佳處理條件是添加0.6 g/100 mL 濃度的MTG 酶與豬血漿蛋白溶液在pH 7 時40 ℃保溫60 min。在這一條件下，酶處理使凝膠硬度顯著增加，并降低凝膠的失水率約3%。值得注意的是，單獨熱處理也能增加凝膠硬度，而MTG 酶的添加和熱處理有協同作用。此外，MTG 酶的添加能顯著提高凝膠彈性，但是對凝膠內聚性沒有顯著影響?？偟膩碚f，以上結果表明豬血蛋白凝膠中添加MTG 酶并保溫一段時間能促進血漿凝膠特性。應該還有許多其他方法來促進血漿凝膠的特性，如可以結合MTG 酶和還原試劑一起發揮作用，或者通過血漿超濾作用增加亞基濃度，然后再進行酶處理，有待于進一步研究。

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