新疆葡萄樹傷流液抗氧化活性及多酚含量測定

朱富榮，伊力哈木·托合提，艾爾肯·依不拉音，*，黃瓊，布熱米古麗·買買提

（1.新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆和田師范專科學校生化系，新疆 和田 848000）

傷流液（bleeding sap）是指從受傷或折斷的植物組織傷口處溢出液體的現象，是由根壓引起的[1]，經剪去葡萄樹的部分枝條末梢，直接接葡萄樹傷流液，收集簡便，而民間將其做為廢料棄去，如果將葡萄樹傷流液進行開發研究，不僅可防止自然資源的浪費，還有利于開發新的具有生物活性的產品。葡萄樹傷流液中含有豐富的營養成分，尤其以鈣、鉀和谷氨酸含量較高[2]。禹婷等[3]報道以核桃，獼猴桃和葡萄為試材，分析和比較了3 種果樹傷流液中游離氨基酸，硝態氮和銨態氮的含量。伊力哈木·托合提等報道了和田葡萄樹傷流液具有抗衰老作用[4]，同時阿吉姑·阿布都熱西提等報道了葡萄樹傷流液的抗氧化活性及熱穩定性[5]。而葡萄樹傷流液中多酚類物質的研究開發卻很少，目前新疆葡萄樹傷流液已檢測到具有抗氧化、清除羥自由基及熱穩定性等活性，原因可能與葡萄樹傷流液中的多酚類物質有關。

亞硝胺是目前所知的最強的化學致癌物質之一，它能引起人和動物肝臟等多種器官的惡性慢性腫瘤。正常情況下，人們直接從食物中攝入的亞硝胺極少，但形成亞硝胺的前體物質卻大量存在于食物以及產生于食物在體內的代謝過程中，特別是亞硝酸鹽在人和動物的胃中更適于合成亞硝胺。因此，清除體內業硝酸鹽是防止癌癥的有效途徑[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄樹傷流液：2012 年4 月初采自于和田市、和田縣、吐魯番鄯善縣、喀什市、阿圖什市，采集后立即冷凍保存，根據需要解凍。

1.2 試劑與儀器

UV-2550 紫外分光光度計：日本島津；移液器（Genex Beta，100-1000 μL）：上海瑞聰生物科技有限公司；梅特勒電子天平-AG135：梅特勒-托利多儀器有限公司；GSF-250-3 超聲清洗器：濟寧科源超聲波設備有限公司；RE-52A 旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠。

沒食子酸標準品（批號：110831-200803）：購自中國藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、抗壞血酸、乙醇、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、無水碳酸鈉、磷酸、鹽酸、溴水等均為分析純；水為二次重蒸水。

1.3 方法

1.3.1 體外清除·OH 的能力

操作按照南京建成生物工程研究所提供的·OH測試盒說明書進行。在反應體系中加入不同產地的新疆葡萄樹傷流液原液0.2 mL，檢測體系中·OH 的剩余量，以VC作為陽性對照。最終結果以抑制率表示。

抑制率（%）=（對照管-測定管）/對照管×100%

取三支10 mL 比色管a、b、c，準確吸取一定量5 μg/mL 的NaNO2溶液兩份，分別加入到a 和c 管中，吸取6 mL 葡萄樹傷流液原液，分別加入到a 和b 管中，反應10 min 后，a、b、c 管中分別加入0.4%的對氨基苯磺酸溶液2.0 mL，搖勻反應5 min，再都加入0.2%的鹽酸萘已二胺1.0 mL，搖勻15 min 后，在最大吸收波長538 nm 處，以b 管為參比測得a 管的吸光度為A，以試劑空白為參比測得c 管的吸光度為A。按下式計算葡萄樹傷流液對亞硝酸鈉的清除率：清除率=[（Ao-A）/Ao]×100%，式中Ao為未加提取液亞硝酸鈉的吸光度，A 為加提取液后亞硝酸鈉的吸光度。

1.3.3 Folin-Ciocalteu 比色法測定葡萄樹傷流液中總多酚含量

1.3.3.1 最佳測定波長的選擇

取0.05 mg/mL 沒食子酸標準溶液及濃縮的樣品液各0.5 mL 于10 mL 的棕色容量瓶中，各加入0.5 mL Folin-Ciocaltou 試劑（按藥典的方法配制），加入3 mL水搖勻后，放置4 min，再加入1.5 mL 10% Na2CO3溶液，蒸餾水定容至刻度，避光靜置120 min，用分光光度計在400 nm～800 nm 波長范圍內分別掃描沒食子酸標準溶液與處理樣品液的吸收光譜，確定其最大吸收波長為760 nm。

1.3.3.2 各試劑用量的選擇

取0.05 mg/mL 沒食子酸標準溶液0.4 mL，分別加入0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻后分別加入3 mL 蒸餾水，4 min 后各加入1.5 mL 10%Na2CO3溶液，并定容至10 mL，顯色后測定其吸光度值，以確定Folin-Ciocalteu 顯色劑的用量，實驗結果表明，隨著Folin-Ciocalteu 試劑的增加，吸光度不斷升高，當吸取量達到0.5 mL 時吸光度趨于穩定，因此選擇加入0.5 mL 的Folin-Ciocalteu 試劑。

取0.05 mg/mL 沒食子酸標準溶液0.4 mL，分別加入0.5 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻后分別加入3 mL蒸餾水，4 min 后分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 10%Na2CO3溶液，并定容至10 mL，顯色后測定其吸光度值，以確定10%Na2CO3溶液的用量。實驗結果表明，隨著Na2CO3溶液的增加，吸光度是先升高后略有下降，當加入1.5 mL Na2CO3溶液時吸光度最大，因此選擇加入1.5 mL 的10%Na2CO3溶液。

1.3.3.3 顯色時間的選擇

精密移取0.05 mg/mL 沒食子酸標準溶液0.4 mL于10 mL 的容量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液0.5 mL，再分別加水3 mL，10%碳酸鈉溶液1.5 mL，蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置4 分鐘以相應的試劑為空白，分別反應10、30、60、90、120、150、180 min 在760 nm 處測定吸光度。實驗結果表明，120 min 以后吸光度趨于穩定，考慮到效率問題，因此顯色時間選擇120 min。

1.3.3.4 測定方法

精密量取葡萄樹傷流液濃縮液（20 倍）0.4 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液0.5 mL，再加蒸餾水3 mL，搖勻，放置4 min 再加10%碳酸鈉溶液1.5 mL，蒸餾水定容至刻度，放置120 min 后，以相應的試劑為空白，依照紫外-可見分光光度法，在760 nm 的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.3.5 標準曲線的建立

精密量取0.05 mg/mL 沒食子酸標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置10 mL 棕色量瓶中，以下同上。

1.3.3.6 穩定性試驗

對Folin-Ciocalteu 比色法測定新疆葡萄樹傷流液進行穩定性試驗，反應完全后，避光下放置0、0.5、1、2 和3 h 后測定的吸光值分別為0.770、0.772、0.778、0.779、0.779。結果表明，該方法在體系反應完全后放置3 h 內測定值仍比較穩定，其相對標準偏差（RSD）為0.556%。

1.3.3.7 精密度試驗

對Folin-Ciocalteu 比色法測定新疆葡萄樹傷流液多酚進行精密度實驗，同一樣品測定6 次，其吸光值分別為0.353、0.354、0.354、0.354、0.353、0.354，其吸光度值的RSD 為0.147%，表明該方法具有較高的精密度，所測結果可靠。

1.3.3.8 重現性試驗

對Folin-Ciocalteu 比色法測定葡萄樹傷流液多酚進行重現性試驗同一批樣品6 份，測定的吸光度值分別為0.339、0.331、0.336、0.352、0.342、0.344.其吸光度值的RSD 為2.11%，表明該法具有良好地重現性。

1.3.3.9 加標回收率試驗

取樣品濃縮液0.2 mL，置于9 個10 mL 的容量瓶中，再分別分加入220、280、340 μg 對照品溶液（0.05 mg/mL），按“1.3.4.4”標準曲線項下的方法，顯色后避光放置120 min，測定吸光度，計算回收率，結果回收率的范圍為96.43%～104.73%。

2 結果與分析

2.1 9 種葡萄樹傷流液清除·OH 能力

按“1.3.1”項下的方法，測定9 種新疆葡萄樹傷流液清除羥自由基的能力，結果見表1。由表1 可知，除吐魯番的無核白、卡西克、白加克外，其余6 個品種的新疆葡萄樹傷流液的抑制率均大于90%，抑制率越大，間接反映了抗氧化活性越強。

2.2 9 種新疆葡萄樹傷流液清除的能力

表1 葡萄樹傷流液清除·OH 和的能力測定Table 1 Hydroxyl radicals and nitrite scavenging ratios of Bleeding sap of Grape tree

2.3 樣品總多酚的含量測定結果

2.3.1 標準曲線的建立

按照“1.3.3.5”項的方法繪制標準曲線如圖1 所示。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve

由圖1 可知，回歸方程為y=0.122 8x+0.029 5，相關系數R2為0.999 7，結果表明：沒食子酸的濃度在0～6 mg/L 范圍內與吸光度有良好的線性關系。通過回歸方程及樣品濃縮液測定的吸光度，可計算出樣品濃縮液的濃度，進一步可以得到各個品種的葡萄樹傷流液的多酚含量。

2.3.2 9 種葡萄樹傷流液的總多酚含量測定結果

精密吸取各樣品的濃縮液（20 倍）0.4 mL，按標準曲線繪制項下的方法，顯色后避光放置120 min，測定樣品的吸光度值，結果見下表2。

從表2 檢測結果得知，不同品種葡萄樹傷流液中的總多酚含量是不同的，即使是同一個產地的不同品種的葡萄樹傷流液中的總多酚含量也是不同的，總多酚含量在不同品種新疆葡萄樹傷流液中有較大差異，其范圍為2.64 mg/L～6.76 mg/L，其中吐魯番地區不同品種的葡萄樹傷流液總多酚含量相對較高，和田地區不同品種的葡萄樹傷流液總多酚含量差異較大。

表2 新疆葡萄樹傷流液總多酚含量Table 2 The Polyphenol content of Bleeding sap of Xinjiang Grape tree

3 結論

3）系統研究了以沒食子酸為標準品，Folin-Ciocalteu 比色法測定新疆葡萄樹傷流液中總多酚的含量。此方法具有操作簡便、精密度高、結果準確可靠等優點，可用于新疆葡萄樹傷流液中總多酚含量的測定。品種間含量的差異，是由于Folin-Ciocalteu 法測出的是多酚類化合物的相對總量，受多酚物質的結構和性質影響很大，不同種植環境、不同種植品種的新疆葡萄樹傷流液的總多酚的含量是有差異的。

4）新疆9 種葡萄樹傷流液清除·OH 的能力大小和多酚含量的多少并不成明顯的比例關系，可能葡萄樹傷流液中的多酚并不是唯一的抗氧化活性物質。

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[5]阿吉姑·阿布都熱西提.新疆葡萄樹上流液抗氧化活性及其檢測方法的研究[M].烏魯木齊：新疆醫科大學藥學院,2008：17-22

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