全身熱療聯合地塞米松對大鼠肺纖維化治療作用

劉小燕，李時悅，陳小波

(1廣州番禺區中心醫院呼吸內科，廣東廣州511400；2.廣州醫學院第一附屬醫院廣州呼吸疾病研究所，廣東廣州510120)

·論著·

全身熱療聯合地塞米松對大鼠肺纖維化治療作用

劉小燕1，李時悅2，陳小波2

(1廣州番禺區中心醫院呼吸內科，廣東廣州511400；2.廣州醫學院第一附屬醫院廣州呼吸疾病研究所，廣東廣州510120)

目的探討全身熱療聯合地塞米松對大鼠肺纖維化的治療作用。方法48只雄性SD(Sprague Dawley)大鼠隨機分為四組，即正常對照組(N組)、模型組(M組)、地塞米松治療組(D組)和全身熱療聯合地塞米松治療組(DW組)，N組氣管內注入生理鹽水，其他三組氣管內注入博萊霉素造模成功后分別給予相應的治療，各組動物在第28天處死，對蘇木精伊紅染色(HE)肺組織病理結果進行半定量評分，用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測肺泡灌洗液(BALF)中IFN-γ的含量。結果DW組與D組比較，前者的纖維化程度減輕(1.250分vs 2.000分，P＜0.05)，BALF中IFN-γ的含量增高[(30.397±5.015)pg/ml vs(23.801±3.256)pg/ml，P＜0.05]。結論全身熱療可以增強地塞米松對大鼠肺纖維化的治療作用。

全身熱療；地塞米松；肺纖維化

特發性肺纖維化(Idiopathic Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種原因不明的慢性炎癥性間質性肺疾病，目前尚無有效的治療藥物可以延長患者的生存期。全身熱療作為一種綠色療法已廣泛應用于腫瘤和一些良性疾病的治療上，尤其是其對化療和放療的增敏作用[1]受到大多數學者的關注，我們從這些研究中發現全身熱療從作用機制、細胞水平以及細胞因子水平等方面可能對治療肺纖維化有利。本試驗通過對大鼠肺組織纖維化的半定量評分和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IFN-γ含量測定，觀察全身熱療聯合地塞米松對大鼠肺纖維化的治療作用。

1 資料與方法

1.1 試劑博萊霉素針劑(日本化藥株式會社，Z50370)；地塞米松磷酸鈉注射液(山東華信制藥有限公司，H37021467)；大鼠IFN-γ酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海森雄科技實業有限公司產品)。

1.2 儀器DK8A恒溫水浴鍋(溫度波動：±0.1，上海精宏試驗儀器有限公司)；6801A熱電偶測溫儀(深圳市勝利高電子科技有限公司)。

1.3 實驗分組、纖維化模型的建立和標本處理

1.3.1 實驗分組和模型建立48只SD雄性大鼠，體重180～220 g，隨機分為四組，即正常對照組(N組)、模型組(M組)、地塞米松治療組(D組)和全身熱療聯合地塞米松治療組(DW組)，用1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后切開大鼠頸部皮膚，肉眼下用注射器將博來霉素按5 mg/kg劑量注入氣管[2]，N組則注入生理鹽水0.25～0.3 ml。N組和M組：造模后每日腹腔注射5%葡萄糖1 ml；D組：造模后每日按3 mg/kg劑量腹腔注射地塞米松注射液；DW組：在D組治療的基礎上，用水浴法給予每次1 h 40℃全身熱療(2次/周)，療程為4周。

1.3.2 標本的獲取和處理各組大鼠于造模后第28天處死，分離出氣管和雙肺，結扎右側肺門，將氣管插管緩緩插入左主支氣管，用注射器將2.5 ml生理鹽水通過導管注人肺內，然后回抽灌洗液，反復10次，最后1次回抽的灌洗液盛入15 ml的離心管，離心管置于冰浴中，重復4次上述操作。對所得標本進行計量，并離心10 min，上清液放入-70℃冰箱中，用于測定IFN-γ含量，取右下肺葉進行病理組織學檢查。

1.4 大鼠肺組織纖維化半定量評分光鏡下(4×10)評估每張切片上肺纖維化的面積，使用AxioVision LE圖像信息采集系統進行圖像采集和評分(蔡司遠東有限公司)。評分標準如表1。

表1 大鼠肺纖維化組織的病理半定量評分標準

1.5 IFN-γ含量測定采用ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ的含量。

1.6 統計學方法采用SPSS12.0軟件包進行統計學分析。所有計量資料以均數±標準差表示，病理半定量資料采用秩和檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05即認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理半定量評分分析與M組比較，D組和DW組肺纖維化范圍和程度均減輕，差異有統計學意義(P＜0.05)；與D組比較，DW組肺纖維化范圍和程度進一步減輕，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.2 BALF中IFN-γ含量比較支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ含量(pg/ml)與N組比較，M組BALF中IFN-γ含量下降，差異有統計學意義(P＜0.05)；與M組比較，D組和DW組BALF中IFN-γ含量均增高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與D組比較，DW組BALF中IFN-γ含量升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同組別大鼠BALF中IFN-γ含量檢測比較

表3 不同組別大鼠BALF中IFN-γ含量檢測比較

注：aM組與N組比較，P=0.027＜0.05，DW組與N組比較，P=0.038＜0.05；bD組與M組比較，P=0.044＜0.05，DW組與M組比較，P=0.003＜0.05；cDW組與D組比較，P=0.006＜0.05。

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3 討論

全身熱療在治療腫瘤和一些良性疾病(慢性盆腔炎、前列腺肥大、痛經等)方面的療效已經被大多數學者認可，但尚未有治療肺纖維化的相關報道。中國熱療治療專家李鼎九在對放療引起的放射性肺炎、肺纖維化患者的藥物治療觀察中發現，同時進行全身熱療患者的肺纖維化程度有所減輕；張杰等[3]對33例放療引起皮下組織纖維化的患者采用微波熱療的總有效率達到87.9%。在預試驗中，我們觀察了單純熱療對大鼠肺纖維化的治療作用，發現肺纖維改善并不明顯，因此我們推測單獨熱療還不足以代替常規藥物達到滿意治療肺纖維化的作用，類似于熱療對腫瘤化療和放療的增敏[4]作用，若其與治療肺纖維化的藥物聯用則可能通過增強機體對藥物的敏感性，增加機體免疫細胞的活性，調節細胞因子的表達等對肺纖維化具有一定的輔助治療作用。本試驗結果表明，熱療聯合激素與單純激素治療相比，試驗大鼠的肺組織病理變化有所減輕，提示熱療對激素治療肺纖維化有一定的增強作用。

作用機制方面，IFN-γ主要由CD8+T細胞和某些CD4+T細胞產生，具有一定的抗纖維化作用，有研究也表明IFN-γ受體缺失可誘發大鼠纖維化[5]，而且目前IFN-γ已用于肺纖維化治療的2期、3期臨床試驗[6]，本實驗結果提示全身熱療可能通過增加IFN-γ的含量從而增強地塞米松對肺纖維化的治療作用。結合既往的一些研究，熱療還可能通過以下四個環節發揮作用：①全身熱療時體溫升高，組織血管擴張，加溫破壞了細胞膜的穩定性，使膜的通透性增加，有利于化療藥物的滲透和吸收[1]；具有一定的熱增強效應。②改善血液微循環，明顯改善肺內的通氣/血流比例而發揮治療作用；同時血循環的改善加速了局部代謝產物的移除，使滲出減少[7]，有利于炎癥消退以及有害細胞因子的清除。③肺纖維化的發病機制認為Th1/Th2細胞因子比例失衡在纖維化的過程中發揮重要的作用[8]，洪曉軍等[9]通過研究觀察到熱療可以提高荷瘤鼠IL-2水平，熱療可刺激B淋巴細胞活化，其釋放的IFN-γ、IL-2等輔助性細胞因子(Th1類)，可糾正Th1/Th2細胞因子失衡達到治療作用。④細胞凋亡方面，IPF患者的凋亡相關基因bcl-2表達下調而Bax明顯上調[10]，在對腫瘤進行熱療的研究中則表現為bcl-2表達上調而Bax成下調趨勢[4,11]。

綜上所述，我們僅從本試驗和理論推測熱療可以增強地塞米松對大鼠肺纖維化的治療作用，其應用到臨床是否能發揮作用、如何應用才能發揮最佳的療效以及其作用機制如何還有待進一步研究和明確。

(志謝：本試驗得到中國腫瘤治療專家李鼎九教授和廣州祈福醫院孔寒夢主任的大力幫助和支持，特此感謝！)

[1]Mohamed F,Marchettini P,Stuart OA,et al.Thermal enhancement of new chemotherapeutic agents at moderate hyperthermia[J].Ann Surg Oncol,2003,10(4):463-468.

[2]高春蘇,陸倫根.纖維化疾病的基礎和臨床[M].上海:上海科學技術出版社,2004:468.

[3]張杰,郭毅,王克蘭,等.微波熱療對組織纖維化近期療效的觀察與分析[J].濱州醫學院學報,2002,25(5):391.

[4]李鼎九,胡自省,鐘毓斌.腫瘤熱療學[M].鄭州:鄭州大學出版社, 2002:93-96,144.

[5]Mora AL,Torres-Gonzalez E,Roias M,et al.Control of virus reactivation arrests pulmonary herpesvirus-induced fibrosis in IFN-γreceptor-deficient mice[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,175 (11):1139-1150.

[6]班健.特發性肺纖維化的治療進展[J].臨床肺科雜志,2011,16 (9):1432-1434.

[7]劉宏亮.毫米波療法的研究應用及有關問題[J].國外醫學:物理醫學與康復學分冊,1998,18:154-156.

[8]Kikuchi N,Ishii Y,Morishima Y,et al.Nrf2 protects against pulmonary fibrosis by regulating the lung oxidant level and Th1/Th2 balance[J].Respir Res,2010,11:31.

[9]洪曉軍,毛祖彝,王升志,等.熱化療對荷瘤鼠IL-2、TNF水平影響的研究[J].四川腫瘤防治,2002,15:65-67.

[10]Kang HR,Cho SJ,Lee CG,et al.Transforming growth factor (TGF)-beta1 stimulates pulmonary fibrosis and inflammation via a Bax-dependent,bid-activated pathway that involves matrix metalloproteinase-12[J].J Biol Chem,2007,282:7723-7732.

[11]Zhang TJ,Hang J,Wen DX,et al.Hippocampus bcl-2 and bax expression and neuronal apoptosis after moderate hypothermic cardiopulmonary bypass in rats[J].Anesth Analg,2006,102:1018-1025.

Therapeutic effect of whole body hyperthermia combined with dexamethasone on pulmonary fibrosis in rats.

LIU Xiao-yan1,LI Shi-yue2,CHEN Xiao-bo2.1.Department of Respiratory Medicine,Guangzhou Panyu People's Hospital,Guangzhou 511400,Guangdong,CHINA;2.Guangzhou Institute of Respiratory Disease,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou 510120,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of whole body hyperthermia combined with dexamethasone in the treatment of pulmonary fibrosis in rats.MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into four groups:normal group(group N),model group(group M),dexamethasone group(group D)and whole body hyperthermia combined with dexamethasone group(group DW).Fibrosis was induced in rats by intratracheal instillation of saline(group N)or bleomycin(the other groups),then each group received corresponding treatment and was put into death after 28 days.Semi-quantitative analysis of the histopathologic changes stained with hemotoxylin and eosin (HE),the concentration of IFN-γ in BALF were measured with ELISA.ResultsThe degree of fibrosis decreased (1.250 vs 2.000,P＜0.05)and the content of IFN-γ in BALF increased[(30.397±5.015)pg/ml vs(23.801±3.256)pg/ml,P＜0.05]significantly in group DW as compared with group D.ConclusionWhole body hyperthermia could enhance the treatment function of dexamethasone for pulmonary fibrosis in rats.

Whole body hyperthermia;Dexamethasone;Pulmonary fibrosis

R-332

A

1003—6350（2013）03—0316—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.03.0141

2012-07-20)

劉小燕。E-mail：liuxiaoyan1892@163.com