星點設計－效應面法優化脂溶性丹參提取物速釋滴丸處方工藝

符少蓮， 馮翠娟， 李 沙

(暨南大學藥學院藥劑學教研室，廣東廣州510632)

丹參為唇形科多年生草本植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。性微寒，味苦，具有活血調經，涼血消癰，清心安神的功效［1］。丹參酮是丹參中具有橙黃色和橙紅色特征的脂溶性有效成分，大量研究表明丹參酮在抗腫瘤、心腦血管疾病、抗菌消炎等方面均有良好的治療作用［2-4］，但丹參酮在水中的溶解度極小，口服給藥生物利用度低，從而影響了其藥效作用的發揮［5-6］。為改善其溶出，已有研究報道將其制成固體分散體、環糊精包合物等［7-8］，均能有效提高其溶出度。但這些研究均以純度很高的丹參酮ⅡA為研究對象，而工業生產中目前主要使用的原料是丹參提取物。為此本研究采用丹參提取物作為研究對象制備滴丸，以提高丹參脂溶性成分的溶出性能。

采用適宜的水溶性基質將難溶性藥物制成滴丸，可有效地提高其溶出性能，且滴丸因具有操作簡便，生產周期短，劑量準確，便于貯存和服用的優點而得到廣泛研究［9］。丹參酮ⅡA是丹參中脂溶性成分的代表［10］，本實驗在前期單因素試驗的基礎上，以丹參酮ⅡA作為代表性成分，測定其累積溶出百分率作為評價指標，采用星點設計－效應面法進一步優化處方，研制速釋型脂溶性丹參提取物滴丸，更適合于工業化生產與臨床用藥需求。

1 儀器與材料

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (鞏義市英峪予華儀器廠);RCZ-8A智能藥物溶出儀 (天津大學精密儀器廠);高效液相色譜儀 (島津公司LC-10A);滴丸機 (廣東正洪公司)。

脂溶性丹參提取物 (丹參酮ⅡA純度40%，廣州美晨藥業有限公司，丹參酮ⅡA純度47%，批號080906);丹參酮ⅡA對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號2006019);聚乙二醇 (PEG)2000(廣東光華化學廠有限公司，20100918);聚乙二醇4000(廣東光華化學廠有限公司，20100413);十二烷基硫酸鈉 (SDS，上海晶純實業有限公司，1098983);甲醇 (色譜純)。

其他試劑和試藥均為分析純，實驗用水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 滴丸的制備 稱取適量PEG 2000與PEG4000于60℃水浴中熔融，加入脂溶性丹參提取物，攪拌一定時間，使其均勻分散，最后將藥液滴入液體石蠟冷卻液中冷凝成丸，待滴丸完全冷卻后，取出滴丸，去除表面附著的液體石蠟，放入真空干燥箱中干燥12 h即得。

2.2 體外溶出試驗 參照《中國藥典》2010年版二部溶出度測定法第一法進行溶出實驗，以1%SDS(十二烷基磺酸鈉)水溶液為溶出介質，溫度(37±0.5)℃，轉速100 r/min進行試驗，于5、10、20、30、45、60 min分別取樣2 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，同時補加等量同溫溶出介質。取續濾液采用HPLC方法測定其中丹參酮ⅡA的量，并計算累積溶出百分率，作為處方優化的評價指標。

2.3 丹參酮ⅡA測定方法的建立 采用HPLC法建立丹參酮ⅡA的測定方法。

2.3.1 色譜條件 漢邦Hedera C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相為甲醇－水 (85∶15);檢測波長為270 nm;體積流量為1.0 mL/min;進樣量為 20 μL。

2.3.2 溶液的制備 (1)對照品溶液:取丹參酮ⅡA對照品約10 mg，精密稱定，置25 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液，再根據需要用甲醇稀釋成相應濃度。 (2)脂溶性丹參提取物溶液:精密稱取脂溶性丹參提取物適量，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得。(3)供試品溶液:取制得的滴丸，研細，取約0.02 g，精密稱定，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇15 mL超聲20 min，再加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。(4)陰性對照液:取對應量的空白載體材料，精密稱定，按供試品溶液項下操作，制成陰性對照品溶液。(5)脂溶性丹參提取物溶出液:精密稱取脂溶性丹參提取物適量，進行溶出試驗，于60 min取樣2 mL，濾過，取續濾液，即得。(6)滴丸溶出液:取某一代表性處方制備的滴丸，進行溶出試驗，于60 min取樣2 mL，濾過，取續濾液，即得。(7)溶出試驗陰性對照液:取對應量的空白載體材料，精密稱定，進行溶出試驗，于60 min取樣2 mL，濾過，取續濾液，即得。

2.3.3 專屬性考察 按2.3.1項色譜條件，分別取丹參酮ⅡA對照品溶液 (40 mg/L)、脂溶性丹參提取物溶液 (含丹參酮ⅡA40 mg/L)、供試品溶液 (含丹參酮ⅡA 40 mg/L)、陰性對照液、脂溶性丹參提取物溶出液、滴丸溶出液、溶出試驗陰性對照液各 20 μL進樣，記錄 HPLC圖譜 (圖 1、2)。提取物中丹參酮ⅡA在所用色譜條件下，分離度好，峰形對稱穩定，保留時間約為9.7 min。載體材料與溶出介質在丹參酮ⅡA色譜峰處無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

圖2 溶出樣品高效液相色譜圖Fig.2 Typical HPLC chromatograms of drug dissolution samples

2.3.4 標準曲線的建立 精密量取適量2.3.2項下的對照品貯備液，用甲醇稀釋成0.2、0.5、1、5、10、20、40、80 mg/L的標準溶液，進樣測定，結果在0.2～80 mg/L內，峰面積 (A)與藥物濃度 (C)有良好的線性關系，回歸方程為A=126831C+4968.1，r=0.9999。

2.3.5 日內與日間精密度試驗 精密吸取丹參酮ⅡA對照品溶液 (40 mg/L)20 μL，連續進樣6次，記錄峰面積，計算RSD為日內精密度;精密吸取丹參酮ⅡA對照品溶液 (40 mg/L)20 μL，連續進樣3次，連續5 d，記錄峰面積，計算RSD為日間精密度。測得日內精密度為1.11%，日間精密度為0.53%，表明方法精密度良好。

2.3.6 穩定性考察 配制3份供試品溶液和3份具代表性的滴丸溶出樣品，置于室溫，分別于0、4、8、12、24 h進樣，記錄峰面積及計算RSD。供試品溶液RSD分別為1.42%、1.92%、1.89%，滴丸溶出樣品 RSD分別為0.75%、1.56%、1.42%，說明待測樣品在24 h內穩定。

2.3.7 重復性試驗 按2.3.2項下方法平行制備六份供試品溶液，分別取20 μL進樣測定，連續進三針，按外標一點法用峰面積計算樣品中丹參酮ⅡA的含量，計算平均值與RSD。測得丹參滴丸中丹參酮ⅡA的質量分數為 (47±0.6)mg/g，RSD為1.31%，說明方法的重復性好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取制得的滴丸，研細，取約8.5 mg，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，共9份，3份一組，分別精密加入相當于樣品處方中丹參酮ⅡA量的80%、100%、120%的對照品溶液，按2.3.2項下方法制成供試品溶液，進樣20 μL測定峰面積，按外標一點法計算丹參酮ⅡA的量，求得高、中、低3個加樣量下的平均回收率分別為100.68%、101.46%、101.67%，表明樣品回收率符合要求。

2.4 單因素考察與結果 按2.1項法制備滴丸，選取兩種載體比例、藥物與載體比例、攪拌時間作為考察因素，以累積溶出百分率為評價指標，通過單因素試驗評價各處方工藝因素對滴丸溶出性能的影響。具體因素水平分別為:PEG 2000∶PEG4000(1∶9、3∶7、5∶5、7∶3)、藥物∶載體 (1∶11、1∶9、1∶7、1∶5)、攪拌時間 (1、2、3 h)。結果見圖3。

由圖3結果可知，以PEG 2000與PEG 4000作為載體材料制備滴丸能有效提高脂溶性丹參提取物的溶出效果，利用SPSS軟件對各取樣時間點的溶出數據分別進行單因素方差分析，結果顯示，兩種載體比例、藥物與載體比例這兩個因素對各時間點溶出結果的影響有顯著差異 (P＜0.05)，攪拌時間對各時間點溶出結果則沒有顯著影響 (P＞0.05)。單因素考察結果顯示PEG 2000∶PEG 4000為3∶7、藥載比為1∶9時，丹參酮ⅡA釋放最快最完全。

2.5 星點設計與處方優化

2.5.1 星點設計實驗與結果 在單因素試驗的基礎上，確定PEG 2000與PEG 4000的比例、藥物與載體比例作為考察因素，以累積溶出百分率為評價指標進行2因素、5水平的星點設計。根據2.4項的單因素考察結果選取兩因素的極大值和極小值水平，各因素水平代碼值和實際操作物理量值見表1。按照星點設計原理安排13次試驗，各試驗的溶出結果見表2。

圖3 處方工藝因素對滴丸溶出效果的影響 (n=3)Fig.3 Effect of the formulation and process factors on the dissolution behaviour of dropping pills(n=3)

表1 各因素各水平的代碼值及實際數值Tab.1 Factors and levels in code and actual values

2.5.2 數據分析 以載體比例和藥載比為自變量，累積溶出百分率的“總評歸一值”為因變量，采用Design Expert 7.0軟件進行多元線性回歸和二次多項式回歸，并以擬合優度 (r)和置信度 (P)作為模型判定標準。

表2 實驗設計及溶出試驗結果Tab.2 Experimental design and results of dissolution test

多元線性模型公式為R=X0+X1A+X2B，二次多項式模型公式為R=X0+X1A+X2B+X3AB+X4A2+X5B2。實驗結果擬合得到的多元線性方程為R=1.509+1.412A– 13.044B(P=0.029，r=0.713)，二次多項式模型方程為:R=－5.189+3.668A+118.581B+42.5AB－10.844A2－721.875B2(P=0.003，r=0.946)，兩種模型均P＜0.05，但線性模型方程的復相關系數r太低，預測性相對較差，因此選擇二次多項式模型進行處方優化，其擬合參數值見表3。

表3 二次多項式模型方程中各項的擬合參數值及統計學檢驗結果Tab.3 Values of fitting parameters in quadratic polynomial model equation and statistical test

2.5.3 效應面優化 根據擬合方程，通過Design Expert 7.0軟件繪制評價指標OD值隨因素變化的效應面圖和等高線圖 (圖4、圖5)。

圖4 等高線圖Fig.4 Contour map

圖5 效應面圖Fig.5 The response surface graph

圖4、圖5顯示，隨著PEG 2000量的不斷升高，溶出呈增加趨勢，但過高會使溶出減少;隨著丹參提取物量的減少，溶出效應升高。從效應面圖和等高線圖可知，當A的取值范圍在0.26～0.40，B的取值范圍在0.09～0.10之間時，OD值落在最高效應值區間，即溶出效果最佳，因此確定兩個因素的最佳取值范圍在此區間。進一步通過Design Expert 7.0軟件預測分析，獲得一組OD響應值最大的優化條件:A為0.35，B為0.09，在此優化條件下，因變量OD值的預測值為0.93。

2.5.4 優化處方驗證 按上述預測的優化處方制備3批樣品，進行驗證試驗，結果見表4。3批樣品的OD實測值與預測值間的偏差均小于5%，表明本實驗設計方法預測性良好。按照單因素實驗獲得的最佳條件 (A=0.3，B=0.1)所制備的滴丸，測得OD值均值為0.85(n=3)。經t檢驗得到，效應面法獲得的優化實驗條件顯著優于單因素實驗法 (P＜0.01)。

表4 星點設計－效應面法優化處方驗證實驗結果Tab.4 Validation of the optimized formulation obtained by central composite design-response surface methodology

3 討論

丹參酮是丹參中含有的脂溶性活性成分，在水中的溶解度小，口服給藥生物利用度低。為改善其溶出，本研究采用固體分散技術，將脂溶性丹參提取物制成滴丸。結合藥典，選取其中最主要的脂溶性成分丹參酮ⅡA(其量約為藥材的0.11% ～0.19%)［11］作為代表性測定成分，評價滴丸對丹參脂溶性成分溶出性能的改善作用。圖2溶出液的色譜圖顯示，制成滴丸后，不但丹參酮ⅡA的溶出明顯增加，在相同的時間點下，提取物中其它各成分的峰面積在滴丸組中也均有不同程度的增高，說明本研究所制備的滴丸可提高丹參提取物中各種脂溶性成分的整體溶出性能，達到了預期目的。

以PEG 2000和PEG 4000作為載體材料制備的脂溶性丹參提取物滴丸中，丹參酮ⅡA的溶出得到極顯著的提高 (P＜0.01)，在20 min中時已達到53%，約為提取物原料的2倍。目前上市的丹參速釋制劑有復方丹參滴丸，但其所含的有效成分主要為丹參的水溶性成分，如丹參素，尚無丹參脂溶性成分的速釋制劑上市。本研究使用工業化生產常用的脂溶性丹參提取物作為原料藥制備滴丸，較單體成分的同類研究成本低，更適合臨床用藥需求，其后期進一步的研發具有較高的可操作性和實際應用價值。

在采用單因素試驗進行初步處方工藝優化時，溶出度隨著PEG 2000用量的增大有增高的趨勢，在PEG 2000與PEG 4000比例為3∶7時溶出度最高，加入過多的PEG 2000不易滴制成丸，因此兩者比例選在3∶7附近較為合適。固定載體比例，丹參酮ⅡA的溶出度隨著藥載比的降低而增加，但當藥載比降低到1∶11時，溶出卻比1∶9時有所減少。這可能是因為載體量越來越高時，載體在溶出過程中易形成集中層，圍繞于藥物顆粒周圍，因而影響了藥物在溶出介質中的溶出［12］，因此藥載比選在1∶9周圍較為合適。

星點設計是國內外近年來常用于優化藥材提取工藝與制劑處方工藝篩選的方法，簡便、直觀，且在模型建立上采用非線性數學模型擬合，復合相關系數較高，預測值更接近真實值［13-15］。與正交設計和均勻設計相比，星點設計試驗所得的信息量更大，采用效應面法分析更直觀，精密度更高，預測性更好。本實驗在單因素考察的基礎上，采用2因素5水平星點設計－效應面法優化了脂溶性丹參提取物滴丸的處方，與正交試驗常用的3水平相比，增加了考察水平，可使優化結果更具可預測性、準確性。星點設計實驗的結果表明，兩種載體的比例、藥物與載體比例對丹參提取物滴丸的溶出性能有顯著影響，通過效應面法預測的優化處方的實驗結果與其函數預測值之間的偏差小于5%，表明此法擬合的數學模型方程對因素水平的優化預測性高。

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