天然抗凍多肽的制備、分離及細菌低溫保護活性研究

趙珺，汪少蕓，李曉坤

(福州大學生物科學與工程學院，福建福州 350116)

0 引言

生活在低溫環境中的許多生物要避免體液結冰，長期的進化過程使其體內出現了一種廣泛且多樣化的新物質——抗凍蛋白(antifreeze proteins，AFPs)，它是一類在結冰或亞結冰條件下，能改變冰晶生長特性和抑制冰晶重結晶從而保護生物有機體免受冰凍傷害的蛋白質，廣泛存在于生物體中［1］.從二十世紀60年代抗凍蛋白被發現以來，引起許多實驗室的研究興趣［2］.

研究表明，抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于局部的特異多肽鏈結構域，并不是整體蛋白質在起作用，而目前的研究卻主要集中在從極地魚類、陸地昆蟲、植物和細菌等生物體中分離純化，并且利用轉基因技術提高產量，這樣得到的抗凍蛋白不僅數量微少而且應用到食品中有一定的安全顧慮，因此，獲得安全的、結構緊湊的特異性高活性抗凍多肽就成為抗凍蛋白迫切的研究方向［3－4］.利用鯊魚皮明膠酶解得到抗凍多肽混合液，經過分離純化，獲得基于食品源的高效特異性抗凍多肽并對其抗凍活性進行表征.選用的材料簡單易得，得到的食品源抗凍多肽安全、無色無味、而且水解液可重復制備.

1 材料與方法

1.1 材料

鯊魚皮，福州永輝超市;復合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，諾維信(中國)生物技術有限公司;酸性蛋白酶，福建福大百特生物公司;大腸桿菌，由本校微生物實驗室提供;

氫氧化鈉、濃鹽酸、氯化鈉、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等，分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司;牛肉膏、蛋白胨，國藥集團化學試劑有限公司;Sephadex G－50常壓凝膠色譜柱、SP－Sephadex C－25陽離子交換樹脂，美國Amersham Pharmacia公司

1.2 主要儀器設備

752 型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;J－25I型高速離心機，美國BECKMAN公司;循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司;N－1001型旋轉蒸發儀，日本東京理化器械株式會社;FE20型pH計，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;FD－3冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司;PYX－PHS－X型恒溫培養箱，上海精宏實驗設備公司;1285超凈工作臺，美國Thermo Forma公司;DSX－280B型不銹鋼手提式滅菌器，上海申安醫療器械廠;HHS恒溫水浴鍋，廈門醫療儀器廠.

1.3 實驗方法

1.3.1 鯊魚皮明膠的制備

1.3.1.1 前處理

將鯊魚皮中殘余的鯊魚肉及脂肪去除干凈，用自來水清洗干凈，瀝干后切成大小1 cm2左右的小塊.

1.3.1.2 提膠

將上述經前處理過的魚皮用0.1 mol·L－1的NaOH溶液(W/V=1∶6)4℃下浸泡24 h，每12 h換一次浸泡液.然后用蒸餾水洗至中性.將鯊魚皮塊瀝干后加入0.03%的HCl溶液(W/V=1∶6)4℃浸泡4 h，使鯊魚皮充分溶脹，然后再用蒸餾水洗至中性.最后，加入蒸餾水(W/V=1∶6)于60℃水浴中提膠5 h，過濾，上清液即為明膠溶液.

1.3.1.3 真空濃縮及冷凍干燥

將上述明膠溶液利用旋轉蒸發儀在50℃下進行真空濃縮后冷凍干燥，即得到明膠干品.

1.3.2 蛋白酶活力的測定

蛋白酶活力的測定參照專業標準SB/T10317－1999［5］.

1.3.3 明膠酶解液的制備

取7.5 g明膠，用蒸餾水溶解并定容至250 mL.用適當濃度的NaOH溶液或HCl溶液調節明膠溶液的pH值至酶最適反應pH，然后在酶的最適反應溫度下水浴保溫10 min.以3 000 U·g－1加酶量根據酶活計算出蛋白酶使用量，加酶，混勻，開始反應并計時，酶解過程中用磁力攪拌器不斷攪動，并用2 mol·L－1NaOH 溶液或 HCl溶液調 pH.酶解時間共為6 h小時，分別在酶解0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h時取樣，在沸水浴中滅酶10 min以終止水解反應，然后迅速冷卻至室溫，置于離心機中，以4 000 r·min－1離心15 min，取上清液，即為明膠酶解產物.

1.3.4 細菌低溫保護活性

細菌低溫保護活性參考文獻［6］.將大腸桿菌以1∶100的比例從種子液接種到液體培養基中，待其濃度達到OD600=0.8左右時稀釋菌液104倍，取900 μL樣品加入到1.5 mL無菌離心管中，再加入100 μL稀釋好的菌液，混勻后取100 μL涂布，每個樣品做兩個平行，37℃倒置培養20 h，菌落計數并計算存活率.剩余部分在－20℃下放置24 h后，按照如前步驟涂布、培養、計數.

1.3.5 抗凍多肽的分離純化

1.3.5.1 凝膠過濾色譜

所用凝膠色譜柱規格為Φ2.6 cm×100 cm，使凝膠充分溶脹后在柱內裝一定體積的去離子水，然后將凝膠與去離子水一起邊攪拌邊倒入保持垂直的凝膠柱中，使凝膠慢慢沉降，從而裝填成均勻、無氣泡、無裂縫的凝膠色譜柱.裝好的凝膠柱用去離子水充分平衡后即可上樣.上樣完畢，開動樣品分部收集器，收集樣品.用可見紫外分光光度計進行檢測.

1.3.5.2 離子交換色譜

所用的離子交換色譜柱規格為Φ1.6 cm×20.0 cm，其溶脹、裝柱、平衡、上樣過程與凝膠柱基本相同，不同的是其洗脫過程采用鹽離子濃度線性梯度洗脫.

2 結果與討論

2.1 酶活力測定

2.1.1 酪氨酸標準曲線的制作

以酪氨酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線如圖1.

2.1.2 蛋白酶酶活

四種蛋白酶在各自最適反應條件下的酶活力如表1所示.其中堿性蛋白酶的活性最高，復合蛋白酶的活性最低.

圖1 酪氨酸標準曲線Fig.1 Tyrosine standard curve

表1 四種酶的酶活力Tab.1 Activity of the four enzymes

2.2 蛋白酶種類及酶解時間篩選

蛋白酶對水解底物的作用位點具有特異性，同一種底物在不同蛋白酶的作用下結果是不同的;同一種酶經過不同時間水解出來的產物也不同.將堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、復合蛋白酶及中性蛋白酶酶解0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h 的酶解產物(30 mg·mL－1)分別進行細菌低溫保護實驗，不同蛋白酶及酶解時間的產物經過24 h低溫處理后大腸桿菌的存活率越高，說明樣品對細菌的低溫保護活性越強，抗凍活性越高，結果如圖2所示.

由圖2可以看出，酸性蛋白酶酶解產物的細菌低溫保護活性普遍比其他三種酶的保護活性高，這可能是由于蛋白酶的酶切位點不同引起的，膠原蛋白經過酸性蛋白酶酶切后所暴露出來的基團會更有利于其發揮抗凍活性.由圖2可知，酸性蛋白酶酶解1h所得的產物細菌存活率最高即抗凍活性最高，達到71.8%.因此，后續實驗選取酸性蛋白酶酶解1 h的酶解產物進行分離.

圖2 不同酶解產物(30 mg·mL－1)的細菌低溫保護活性Fig.2 Hypothermia protection activity of hydrolysates(30 mg·mL－1)using different proteases

2.3 抗凍多肽的分離

2.3.1 常壓凝膠過濾層析(Sephadex G－50)

選取酸性蛋白酶酶解1 h得到的酶解多肽產物進行第一步分離.如圖3所示，經過Sephadex G－50常壓凝膠過濾色譜柱得到兩個明顯的峰，將其命名為S1與S2，S1在洗脫峰中優先出現，說明S1組分的分子量大于S2組分的分子量.收集兩個組分，在濃度為1.25 mg·mL－1時進行細菌低溫保護實驗，測細菌的存活率，篩選抗凍活性較高部分進行下一步分離.結果見圖4和圖5.

圖4為低溫處理前后加有空白對照、S1組分和S2組分的細菌生長情況，由圖4可知，未經過低溫處理時，空白對照組和實驗組對應的平板都長出較多的大腸桿菌菌落，經過24 h低溫處理后，空白對照組平板的菌落數顯著下降，而實驗組仍有部分大腸桿菌菌落長出，這表明實驗組S1、S2組分在低溫下對細菌有保護作用.

圖3 明膠水解產物的Sephadex G－50色譜圖Fig.3 Elution profles of gelatin hydrolysate on Sephadex G－50 column

圖4 低溫處理前后加有空白對照、S1組分和S2組分(1.25 mg·mL－1)的細菌生長情況Fig.4 Growth of bacteria before and after cold treatment with the addition of S1and S2(1.25 mg·mL －1)

圖5為空白對照、S1組分和S2組分的細菌低溫保護活性.大腸桿菌存活率越高，也就說明抗凍活性越高.由圖可知加無菌水的空白對照組的大腸桿菌經過－20℃ 24 h的低溫處理后存活率僅為0.6%，而加了S1、S2組分(1.25 mg·mL－1)的大腸桿菌的存活率分別為47.7%和15.8%.這表明S1和S2組分在低溫下對大腸桿菌都有一定的保護作用，而且分子量較大的S1組分的抗凍活性大于分子量較小的S2組分的抗凍活性.

圖5 空白對照、S1組分和S2組分(1.25 mg·mL－1)的細菌低溫保護活性Fig.5 Hypothermia protection activity of control，S1and S2(1.25 mg·mL－1)

圖6 S1組分的SP－Sephadex C－25離子交換色譜圖Fig.6 Elution profle of fraction S1on SP － Sephadex C－25 column

2.3.2 常壓離子交換色譜(SP－Sephadex C－25)

將經過Sephadex G－50柱分離得到的有較高抗凍活性的S1組分用SP－Sephadex C－25色譜進行進一步的分離.由圖6可知，經過SP－Sephadex C－25色譜柱將S1組分分成了兩個部分，將其命名為P1和P2，其中P1是未吸附組分，P2是吸附組分.在pH6.0的條件下，P1組分帶負電，偏酸性，pI＜6.0，無法與陽離子交換柱中的陽離子進行交換而優先被洗脫下來，而P2組分帶正電，偏堿性，pI＞6.0，能與陽離子交換柱中的陽離子進行交換而吸附在上面，只有經過高鹽離子洗脫才能被洗脫下來.收集P1、P2組分，在濃度為500 μg·mL－1時進行細菌低溫保護實驗，篩選抗凍活性較高部分.結果見圖7和圖8.

圖7為低溫處理前后加有空白對照、P1組分和P2組分的細菌生長情況.由圖可知，在未經過低溫處理時，空白對照組和實驗組對應的平板都長出了較多的大腸桿菌菌落，經過24 h低溫處理后，空白對照組平板未長出大腸桿菌菌落，這說明低溫處理已經將大腸桿菌完全殺死，而實驗組仍有部分大腸桿菌菌落長出，這表明實驗組P1、P2組分在低溫下對細菌有保護作用.

圖7 低溫處理前后加有空白對照、P1組分和P2組分(500 μg·mL－1)的細菌生長情況Fig.7 Growth of bacteria before and after cold treatment with the addition of P1and P2(500 μg·mL －1)

圖8為空白對照、P1組分和P2組分的細菌低溫保護活性.大腸桿菌的存活率的大小可以反映出P1、P2組分的細菌低溫保護活性大小，也就是抗凍活性的大小.由圖可知，加無菌水的空白對照組的大腸桿菌經過－20℃ 24 h的低溫處理后存活率為0.0%，而添加了P1、P2組分(500 μg·mL－1)的實驗組大腸桿菌的存活率分別為20.4%和80.8%，這就表明P1和P2組分在低溫下對大腸桿菌都有一定的保護作用，而且帶正電荷偏堿性的P2組分的抗凍活性大于帶負電荷偏酸性的P1組分的抗凍活性.

圖8 空白對照、P1組分和P2組分(500 μg·mL－1)的細菌低溫保護活性Fig.8 Hypothermia protection activity of control，P1and P2(500 μg·mL －1)

3 結論

用熱水抽提法提取了鯊魚皮明膠并應用于后續制備抗凍多肽的材料.以酶解產物的細菌低溫保護活性為指標，從復合蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶中篩選得到了酶解鯊魚皮明膠的最適蛋白酶種類及酶解時間，即酸性蛋白酶酶解1 h，酶解條件為:酶解溫度50℃、pH 3.0、酶/底物3 000 U·g－1、底物濃度3%.通過Sephadex G－50常壓凝膠過濾色譜及SP－Sephadex C－25色譜部分分離得到了細菌低溫保護活性較高的抗凍多肽混合物P2，該混合物是酸性蛋白酶酶解1h酶解產物中分子量較大的一部分并且其pI＞6.0，在細菌低溫保護活性測定實驗中，該混合物與空白對照及P1組分相比表現出了對大腸桿菌非常顯著的保護活性(P＜0.01).因此，在今后的研究中，我們將利用更多的分離手段得到抗凍活性更高，更純的抗凍多肽.

［1］王書平，孔祥會.魚類抗凍蛋白研究［J］.安徽農業科學，2010，38(15):7 888－7 890.

［2］汪少蕓，趙珺，吳金鴻，等.抗凍蛋白的研究進展及其在食品工業中的應用［J］.北京工商大學學報，2011，29(4):50－57.

［3］Wang Shao－ yun，Agyare K，Damodaran S.Optimization of hydrolysis conditions and fractionation of peptide cryoprotectants from gelatin hydrolysate［J］.Food Chemistry，2009(115):620 －630.

［4］Wang Shao－yun，Damodaran S.Ice－structuring peptides derived from bovine collagen［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(12)，5 501－5 509.

［5］SB/T10317－1999蛋白酶活力測定法［S］.北京:中國標準出版社，1999.

［6］Zhang Dang－quan，Liu Bing，Feng Dong－ru，et al.Expression，purification，and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants［J］.Protein Expression and Purification，2004，35(2):257 －263.