兔BBMSCs體外培養(yǎng)及其與水凝膠復合體的制備

江仲超

吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科，吉林長春 130021

將與治療有關的細胞、干細胞接種于特定性能的三維生物支架材料上增殖培養(yǎng)后移植到體內(nèi)受損組織處來修復受損的組織[1]，這就是組織工程。原位成膠塑型隨意、操作簡單、創(chuàng)傷小是可注射水凝膠的優(yōu)點，因此受到人們的關注。生物相容性良好，無免疫原性和可生物降解吸收等優(yōu)良性能是水凝膠生物支架被廣泛應用于基礎生物醫(yī)學與臨床領域[2]的原因。研究表明物理水凝膠可制成一種可注射性支架，在室溫下為液態(tài)，注射到體內(nèi)時會變?yōu)槟z。本實驗將制備骨髓基質(zhì)干細胞與水凝膠復合體，并檢測細胞存活情況及其生物相溶性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑DMEM 培養(yǎng)基；胎牛血清、胰蛋白酶；MTT試劑，DMSO試劑。

1.1.2儀器倒置相差顯微鏡（Olympus）、CO2孵箱（BB16UV）、臺式高速離心機[T GL-16G（B）]、超凈工作臺，DG5031型酶聯(lián)免疫檢測儀。

1.1.3動物日本大耳白兔(吉林大學實驗動物中心)。

1.2 方法

1.2.1兔BMSCs的體外分離培養(yǎng)取3周日本大耳白兔，雌雄不拘。耳緣靜脈空氣栓塞處死后置于75%酒精浸泡約5~10 min，無菌條件下取股骨、脛骨，注射器吸取20 mL PBS沖洗髓腔兩遍，沖洗液離心棄掉含有脂肪的液體，達到初步純化，后用培養(yǎng)液吹散細胞，制成細胞懸液接種于塑料培養(yǎng)瓶中，飽和濕度37℃在5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，72 h后半量換液，將未貼壁的細胞全部棄掉，以后每周換液2次。細胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶底壁時，胰酶消化，10%胎牛血清L-DMEM終止消化，離心制成懸液，105/mL傳代。

1.2.2 PLGA-PEG水凝膠的制備每個青霉素小瓶中稱取PLGAPEG粉末0.5 g，密封好紫外燈照射滅菌20 min于超凈臺中在每小瓶材料中加入培養(yǎng)液1.5 mL密封后置于4℃冰箱保存。

1.2.3 BBMSCs與水凝膠復合物制備取生長良好的第三代BBMSCs進行消化，1500 rpm離心10 min，細胞沉淀，以1 mL培養(yǎng)液重懸細胞進行細胞計數(shù)細胞數(shù)約為106個，在5 mL離心管中加入水凝膠溶液0.5 mL，細胞懸液0.5 mL，充分混勻，密封離心管，置于4℃冰箱中保存。

1.2.4水凝膠的細胞相容性研究取生長良好的第三代BBMSCs，調(diào)節(jié)細胞的濃度, 使得細胞的個數(shù)為104個，將細胞接種到96孔板中。設置空白對照及陽性對照孔，放入培養(yǎng)箱中孵育24 h至細胞貼壁。實驗孔中加入180 μlPLGA-PEG溶液，濃度依次成倍遞減，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。實驗孔每孔加入 MTT溶液20 μl，后繼續(xù)培養(yǎng)4 h；4 h后將孔中液體棄掉，每也加入200 μl DMSO，酶聯(lián)免疫檢測儀測量492 nm處細胞的 OD值。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)的觀察

骨髓基質(zhì)干細胞的培養(yǎng)瓶中細胞在倒置相差顯微鏡下觀察多數(shù)為圓形。少數(shù)細胞在原代BMSCs培養(yǎng)4 h后即有貼壁生長，7天后全量換液可見細胞呈多角形、或長梭形散布于瓶底。下圖為原代細胞生長曲線（圖1）。

圖1 原代細胞生長曲線

2.2 水凝膠成膠時間

圖2 PLGA-PEG相圖

應用試管倒置法測水凝膠成膠溫度，配制不同濃度的PLGA-PEG溶液，置于恒溫水浴中，從5℃開始，每10 min升高1℃，倒置試管30 s不流動定義為成膠，測得成膠溫度30℃。下圖為 PLGAPEG相圖（圖2）。

2.3 水凝膠的生物相溶性

應用MTT試驗測定PLGA-PEG水凝膠的生物相溶性。將注有骨髓基質(zhì)干細胞懸液而沒有加PLGA-PEG水凝膠的孔做為空白對照。將注有骨髓基質(zhì)干細胞懸液加PEI水凝膠的孔做為陽性對照。骨髓基質(zhì)干細胞的活性隨著PLGA-PEG的濃度增加而逐漸減低；陽性對照組也顯示出相似的趨勢，但是PLGA-PEG組細胞活性要高于陽性對照組。可知，PLGA-PEG水凝膠具有較低的細胞毒性，具有良好的生物相溶性。

3 討論

作為一群存在于骨髓中的非造血干細胞，骨髓基質(zhì)干細胞（bone marrow stem cell，BMSC）目前已成為應用較廣泛的重要種子細胞之一[4]。因其具有較強的自我更新能力、多向分化潛能和可塑性能、細胞[3]BMSC取材方便、在體外培養(yǎng)體系中具有較強的增殖傳代能力，免疫活性低的諸多優(yōu)點。骨髓中BMSC的含量約占骨髓有核細胞的1/10萬，含量極低，難以滿足細胞工程的需求[5]。所以要應用其中的BMSC，就必須將它從造血系細胞中分離出來。因此,要進一步開展BMSC應用研究的實驗首先必須建立體外分離、純化和大量擴增BMSC的方法，探索保持其增殖潛能的適宜培養(yǎng)條件。

室溫下為液態(tài)、體溫下成膠是PLGA-PEG水凝膠的獨特性質(zhì)，且與以往的 含有PEG水凝膠相比，具有更小的細胞毒性、更加良好的細胞相容性[6]。BMSCs在PLGA-PEG水凝膠表面生長的形態(tài)良好，數(shù)量多。通過MTT試驗可見PLGA-PEG水凝膠具有良好的生物相容性。BMSCs能夠在水凝膠的內(nèi)部伸展和生長，可模擬生物體內(nèi)細胞外基質(zhì)環(huán)境，為細胞提供支持和固定等作用。本研究構(gòu)建出的PLGA-PEG水凝膠可為細胞提供支持和固定，還可以調(diào)節(jié)細胞間的溝通等作用。結(jié)構(gòu)及功能也與細胞外基質(zhì)相似，作組織工程用生物支架材料十分理想。

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