高分子量裂褶菌多糖發酵培養基的優化組合

張雖栓，王 霞

（河南質量工程職業學院食品與化工系，河南平頂山467000）

高分子量裂褶菌多糖發酵培養基的優化組合

張雖栓，王 霞

（河南質量工程職業學院食品與化工系，河南平頂山467000）

目的:優選高分子量裂褶菌多糖的培養基的最佳組合.方法:對提高高分子量裂褶菌多糖的質量分數的培養基組合進行了單因素和正交試驗研究，以確定最佳實驗條件.結果:KH2P04濃度為0.3%、3-吲哚丁酸的濃度為0.04%；發酵培養條件的選擇是：接種量為13%(V/V).結論:高分子量裂褶菌在優化的培養基和發酵培養條件下得到高分子量裂褶菌多糖的質量分數達1.768%.

裂褶多糖；分離純化；培養；正交試驗

裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.簡稱SPG)是一種珍貴的藥食兼用真菌，裂褶菌胞外多糖是菌體經深層發酵產生的中性胞外多糖，由單一的β-(1-3)-D-葡聚糖組成的螺旋結構和良好的水溶性，在調節免疫功能、抗腫瘤、抗輻射等方面有顯著的療效[1]，經硫酸酸化后具有抗HIV活性，能抑制HIV-1產生的細胞裂變[2].其分子量從十幾萬到上百萬不等.然而，SPG的結構和分子量不同嚴重影響其生物學活性及應用.文獻報道，裂褶胞外多糖的相對分子質量多在80-100kDa[3-6]之間，而分子量在100kDa以上的裂褶菌多糖具有較強的抗腫瘤活性，在醫藥領域的應用最為廣泛，需求量最大[7].我們在微生物發酵技術研究的基礎上，利用正交試驗的方法優化培養基的組合，改進培養工藝，提高裂褶菌多糖的質量分數，為裂褶菌菌的產業化栽培和進一步的開發應用提供支持.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裂褶菌種：昆明科技開發有限公司提供.

1.2 設備與儀器

恒溫搖床：中國科學院武漢科學儀器廠；

HZQ-F280全溫度振蕩培養箱：太倉市華美生化儀器廠；

真空干燥箱2K-82A型：上海市實驗儀器總廠；

pH計320-S型：METTLERTOLED；

UV-2102PC紫外——可見分光光度計：德國Bruker公司；

1.3 實驗方法

1.3.1 培養條件

裂褶菌種采用PDA固體培養基，培養基是由馬鈴薯180g/L,KH2PO42.8g/L,葡萄糖18g/L，Mg-SO4.7H2O1.4g/L,蛋白胨4.9g/L,pH=5.8，瓊脂20 g/L組成.配好的PDA培養基裝在試管中，于140℃時滅菌20Min，冷卻，將菌種接種到試管斜面培養基上，靜置、活化4d，活化后的菌種接入裝有50ml培養基的錐形瓶中，28℃下培養1.5d，得液體菌種；接著接種到固體培養基27℃下，培養,7d，菌絲長滿后備用[8,9].

1.3.2 裂褶菌多糖百分含量測定方法

裂褶菌多糖百分含量的測定方法：采用常用的苯酚-硫酸比色法測定[10].

2 結果與討論

2.1 培養基的優化

不同培養基的選擇對高分子量裂褶菌多糖質量分數有直接的影響，設定了碳源、氮源、KH2PO4、3-吲哚乙酸（IBA）四個因素對高分子量裂褶菌多糖培養基的選擇進行了試驗.

2.1.1 最佳碳源作為培養基對高分子量裂褶菌多糖質量分數的影響

實驗選取了1.葡萄糖（10%）、2.蔗糖（10%）、3.麥芽糖（10%）、4.葡萄糖（10%）+羧甲基纖維素（1%）、5.玉米淀粉、6.果糖（10%）作為待選碳源[11-12].發酵完成后，測定多糖含量；結果如圖1表明，葡萄糖（10%）+羧甲基纖維素（1%）是該菌種發酵生產的最佳碳源，多糖產量可達1.8%.

圖1 不同碳源對裂褶菌多糖質量分數的影響

圖2 葡萄糖含量對裂褶菌多糖質量分數的影響

最佳碳源濃度的大小對菌體的生長速度、代謝、產物的合成以及氧氣的流通量多少都會造成影響.若碳源用量過少，菌體生長和產物合成都會停止，反之，則會出現抑制生長的現象.如圖2所示，在葡萄糖濃度偏低或偏高時都會對菌體生長及多糖的合成形成抑制，使合成速率減慢，導致質量分數降低.因此，碳源濃度的大小對微生物發酵生長具有相當重要的作用.經單因素分析，該實驗選用12%的葡萄糖做為最佳碳源.

圖2 葡萄糖含量對裂褶菌多糖質量分數的影響

2.1.3 KH2PO4的濃度對高分子量裂褶菌多糖多糖含量的影響

從圖3可知，KH2P04的濃度對裂褶菌多糖產量的影響表現出最適濃度效應.隨著KH2P04濃度的增加，裂褶菌多糖的質量分數也在不斷的提高，當KH2P04濃度達一定值后繼續升高時，裂褶菌多糖的質量分數則降低，因此，KH2P04最適添加量為0.3%.

圖3 KH2P04的含量對裂褶菌多糖產量的影響

2.1.4 3-吲哚乙酸的濃度對高分子量裂褶菌多糖多糖含量的影響

3-吲哚丁酸是一種植物細胞生長促進劑，它能夠刺激植物細胞快速生長，分別以3-吲哚丁酸添加量為0.02%、0.05%、0.1%和0.15%在培養基進行培養，結果見圖4.

由圖4可知，開始，隨IBA含量的不斷提高，裂褶菌多糖的產量也隨之增加，但當IBA濃度過高時又降低了裂褶菌多糖的產量，故IBA含量對裂褶菌多糖促進作用的最佳濃度分別為0.04%.

圖4 IBA的含量對裂褶菌多糖質量分數的影響

2.1.5 發酵培養條件的正交試驗優化

表1培養基優化的正交試驗因素及水平表

表1 正交設計試驗結果

由表1正交試驗數據可以看出,實驗得到裂褶菌多糖的質量分數最高達到1.768%,最佳水平組合是A3B2C3D2,根據表中極差R的分析，各個因素對裂褶菌多糖質量分數的影響順序是A>D>C>B,因此，最佳組合為A3B2C3D2.即加人葡萄糖的含量達12%，酵母粉含量達0.8%，KH2P04的含量達0.3%，3-吲哚丁酸的含量為0.04%.

3 裂褶菌多糖的純化與分子量的測定

3.1 裂褶菌多糖的純化

經過發酵培養的菌絲體→粉碎→熱水浸泡→乙醇多次沉淀→洗滌→熱水溶解→過濾，濃縮→粗多糖→活性炭褪色→Sevag法脫蛋白→裂褶菌多搪純品.

3.2 裂褶菌多糖分子量的測定

裂褶多糖分子量的測定：采用高效凝膠色譜法，利用標準多糖溶液繪制標準洗脫曲線，再根據裂褶菌多糖的洗脫曲線與標準洗脫曲線做比較，查表可知，所得多糖的分子量約為510kDa.

4 結論

(1)經單因素實驗確定了裂褶菌生長最適宜的培養基成分為:以0.8%酵母粉和0.2%NH4NO3為混合氮源，3-吲哚丁酸的濃度為0.04%，KH2P04濃度為0.3%，以12%的葡萄糖為最佳碳源時，裂褶多糖的提取率最高.

(2)用高效凝膠色譜分析確定樣品單糖組分為具有良好水溶性的β-(1-3)-D葡聚糖，分子量約為510kDa.研究可知：裂褶菌多糖在調節免疫功能、抗腫瘤和抗輻射活性均與多糖的結構和相對分子質量的大小有關，較大分子量的裂褶多糖才具有更加顯著地抗腫瘤和輻射活性，本實驗為后期研究高分子量裂褶多糖的培養和在藥用領域的開發奠定了理論基礎.

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1673-260X（2013）12-0060-03