狼尾蕨體細胞耐鹽突變體篩選技術

葉曉青， 佘建明， 賈新平， 梁麗建， 尤 仙

(江蘇省農業科學院農業生物技術研究所，江蘇省農業生物學重點實驗室，江蘇 南京 210014)

蕨類植物又稱羊齒植物，是植物界中的一個大群。在植物分類中，蕨類植物屬于苔蘚植物和被子植物之間的一個過渡類型，是維管植物進化過程中的一個關鍵環節。蕨類植物的生活史由2個世代交替完成，即孢子體和配子體世代。2個世代都能獨立存活，這在植物界是獨一無二的。蕨類植物的繁殖方式分為有性繁殖(孢子繁殖)、無性繁殖(營養繁殖)和組織培養，育種方法為引種馴化［1］。

自Nabors等［2］首次報道從煙草細胞系成功地篩選出耐鹽突變體再生植株之后，目前有關植物篩選耐鹽細胞系與變異體或突變體研究已有大量報道，涉及的植物種類超過40種。植物細胞進行耐鹽突變體篩選，尚有待建立高效植株再生技術體系，克服耐鹽細胞系難以再生完整植株的障礙和提高耐鹽突變體檢測效果［3］。本研究以狼尾蕨無菌苗葉片為外植體材料，在建立離體培養植株再生技術的基礎上，探討不同濃度氯化鈉對葉片不定芽誘導能力的影響，試圖建立氯化鈉直接篩選法獲得耐鹽突變體再生植株的技術體系，并對體細胞突變體進行與耐鹽性相關的分子檢測，為開展蕨類植物細胞工程育種技術研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以狼尾蕨(Davallia bullata)無菌試管苗的葉片為外植體材料。

1.2 培養基和培養方法

基本培養基由MS大量元素、微量元素［4］和B5維生素［5］組成，添加蔗糖30 g/L，瓊脂條為8 g/L。不定芽誘導培養基在基本培養基基礎上附加1.0 mg/L CPPU+0.1 mg/L IBA，不定芽生長培養基在基本培養基基礎上附加0.5 mg/L CPPU+0.1 mg/L IBA，成苗和生根培養基在基本培養基基礎上附加0.2 mg/L IBA。培養基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調整pH值至5.8。

狼尾蕨葉片誘導不定芽植株再生的培養方法詳見前期報道［6］。培養室溫度為(26±2)℃，光照強度為1 500 lx，光照時間為16 h。

1.3 NaCl篩選方法

在不定芽誘導培養基上加入 NaCl，NaCl濃度(質量與體積比)分別為0(對照)、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%和0.8%。采用直接篩選法，培養30 d統計不定芽的誘導率。

不定芽誘導率=誘導產生不定芽的葉片數/接種的葉片總數×100%

1.4 與耐鹽性相關SSR分子標記方法

基因組 DNA提取和檢測:分別取0、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%NaCl濃度篩選得到的再生植株混合株的幼葉為材料，采用改良的CTAB方法提取基因組DNA。基本步驟如下:(1)取幼嫩葉片，加1%不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，用液氮磨至粉狀;(2)加入600 μl十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)抽提緩沖液，混勻，65℃水浴1 h;(3)冷卻至室溫，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻;(4)10 000 r/min離心10 min;(5)吸上清液，轉入含有異丙醇的離心管內，上下搖動30 s，充分混合至能見到DNA絮狀物;(6)10 000 r/min離心1 min，倒掉液體;(7)加入300 μl含有RNA酶的TE緩沖液溶解DNA，37℃恒溫過夜;(8)加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻，10 000 r/min離心10 min;(9)取上清液，加入 720 μl的75%乙醇及80 μl 5 mol/L醋酸鈉，輕輕轉動，使DNA塊狀物浮游于液體中;(10)放置30 min，10 000 r/min離心1 min，倒掉液體，再加入1 000 μl 70%的乙醇;(11)10 000 r/min離心 1 min，DNA沉淀自然風干，加入50～100 μl的 TE緩沖液，使DNA溶解。經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，置于－20℃冰箱保存備用。

PCR反應體系:PCR反應總體積為20.0 μl，含有 10 × PCR 緩沖液 2.0 μl，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，SSR 引物組合(10 μmol/L)1.0 μl，基因組 DNA(30 ng/μl)2.0 μl，Taq DNA 聚 合 酶 (2.5 U/μl)0.2 μl，ddH2O 11.3 μl。反應在 MJ Research Thermal Cycler PTC-100PCR儀上進行，PCR擴增程序為:94℃預變性3 min;94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，32個循環;72℃延伸10 min;4℃保存。PCR產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上恒壓(150～200 V)電泳1 h左右，參照快速銀染法對PCR產物進行銀染檢測［7］。

本試驗所用的248個SSR分子標記，均勻分布于整個基因組和適用于麥類作物擴增的引物組合，包括248條正向引物和248條反向引物［8］。

2 結果

2.1 NaCl濃度對誘導不定芽的影響

在附加NaCl的不定芽誘導培養基上狼尾蕨葉片誘導不定芽結果顯示:隨著NaCl濃度的提高，接種的葉片褐化率逐步提高(圖1和圖2)，不定芽誘導率逐步下降。當 NaCl濃度為 0、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%時，不定芽誘導率分別為80.2%、28.4%、20.6%、15.9% 和 7.8%。NaCl濃度為0.8%時，葉片徹底喪失不定芽的誘導能力(表1)。

表1 NaCl濃度對誘導不定芽的影響Table 1 Effects of NaCl concentrations on the induction of adventitious bud from Davallia bullata leaves

圖1 在無NaCl培養基上誘導的不定芽Fig.1 The adventitious buds induced from the leaves of Davallia bullata in NaCl-free medium

圖2 在0.6%NaCl培養基上誘導的不定芽Fig.2 The adventitious buds induced from the leaves of Davallia bullata in 0.6%NaCl medium

0～0.4 %NaCl濃度為一敏感區，葉片誘導不定芽頻率從80.2%降至28.4%;0.6%～0.7%NaCl為另一敏感區，不定芽誘導率從15.9%降至7.8%。試驗中觀察到葉片經過NaCl篩選誘導產生不定芽的時間推遲3～5 d。不定芽轉到無NaCl的增殖培養基上恢復正常生長，在成苗和生根培養基上可以得到完整的再生植株(圖3)，其移栽成活率略低于對照。

圖3 0.6%NaCl篩選得到的再生植株Fig.3 The regenerated plantlets selected with 0.6%NaCl

與以通過愈傷組織分化再生植株途徑獲得的愈傷組織為外植體材料相比較，通過不定芽誘導再生植株途徑，以葉片為外植體材料NaCl篩選濃度總體上偏低，因此宜選用較高濃度的NaCl。以狼尾蕨無菌苗的葉片為外植體材料，0.6% ～0.7%NaCl是較為適宜的耐鹽突變體篩選濃度。

2.2 與體細胞突變體耐鹽性相關SSR標記

在供試的248對引物組合中，有9對引物組合在野生型狼尾蕨和耐鹽突變體植株之間PCR擴增存在多態(表2)。引物WXE-56在野生型狼尾蕨中可以擴增出約1 500 bp和1 000 bp 2條特異性條帶，而在經過0.4%、0.5%、0.6%和0.7%NaCl篩選獲得的突變體植株中均無法擴增出以上特異性條帶;在經過0.5%、0.6%和0.7%NaCl篩選獲得的突變體植株中均可以擴增出約700 bp的特異性條帶，并且經過0.7%NaCl篩選獲得的突變體植株中還可以擴增出約600 bp的特異性條帶，而在野生型狼尾蕨中均缺少以上特異性擴增條帶(圖4A)。引物WXE-204在野生型材料狼尾蕨中可以擴增出約600 bp的特異性條帶，而在經過0.5%、0.6%和0.7%NaCl篩選獲得的突變體植株中均無法擴增出該特異性條帶;在經過0.5%NaCl篩選獲得的突變體植株中可以擴增出約1 000 bp特異性條帶，經過0.6%NaCl篩選獲得的突變體植株中可以擴增出約500 bp和400 bp的特異性條帶，經過0.7%NaCl篩選獲得的突變體植株中可以擴增出約420 bp和450 bp的2條特異性條帶，而在野生型材料狼尾蕨中均無法擴增出以上特異性條帶(圖4B)。因此，WXE-56和WXE-204可用作狼尾蕨體細胞耐鹽突變體鑒定的適宜引物。

表2 SSR引物序列Table 2 Primer sequences used for SSR analysis

圖4 耐鹽性相關SSR標記的擴增結果Fig.4 Amplification results of regenerated plantlet of D.bullata by SSR markers associated with salt tolerance

3 討論

愈傷組織是目前普通采用的植物突變體篩選的外植體材料［9-11］。耐鹽突變體篩選以NaCl為篩選劑，選擇方法為直接篩選和間接篩選2種方法。直接篩選法，即將愈傷組織直接置于高濃度NaCl(1.5% ～2.0%)的培養基上;間接篩選法，即從0.2%至2.5% 逐級提高NaCl濃度，將愈傷組織在每級培養基上培養1代至數代，最終獲得不同抗鹽水平的變異素［12］。在植物體細胞培養中，就遺傳穩定性而言，國內外學者普遍認為，外植體材料通過誘導不定芽再生植株途徑比經過愈傷組織脫分化再生植株途徑更為適宜。以狼尾蕨的葉片與其他植物的愈傷組織作為突變體篩選材料相比較，葉片對NaCl篩選濃度的反應更為敏感。本試驗中，狼尾蕨葉片在0.8%NaCl選擇下徹底喪失不定芽的誘導能力，因而認為0.6% ～0.7%NaCl為適宜的篩選濃度。

簡單重復序列(Simple sequence repeat，SSR)標記是基于PCR基礎上的第二代分子標記，與其他分子標記相比，具有呈共顯性、數量豐富、重復性高、穩定性好和結果可靠等優點［13］。本試驗在248對適用于麥類作物擴增的引物組合中發現有9對引物在狼尾蕨野生型和耐鹽突變體植株之間PCR擴增存在多態，表明SSR標記方法適用于狼尾蕨體細胞耐鹽突變體分子鑒定。

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