解磷、固氮、產吲哚乙酸微生物菌株的篩選及其對植物的促生效果

王奎萍， 鄭 穎， 褚光耀， 牛冬冬

(1.南京農業大學植物保護學院，江蘇 南京 210095;2.揚州市職業大學園林園藝學院，江蘇 揚州 225009)

氮素、磷素是植物生長發育必不可少的元素，農作物的需要量巨大［1］。自然界中氮素的含量雖然極為豐富，但植物一般不能直接利用［2］，而磷在土壤中分為無機磷和有機磷，無機磷主要以磷酸三鈣的形式存在，溶解性差，難于被植物吸收［3］。吲哚乙酸是一種植物體內普遍存在的內源生長素，屬吲哚類化合物，可以顯著促進植物的生長發育。

研究發現，土壤中存在著一些微生物，能夠將植物難以吸收利用的磷轉化為可吸收利用的狀態［4］，這些微生物稱為解磷菌。解磷細菌(PSB)分為2種:解無機磷細菌和解有機磷細菌。解無機磷細菌的主要作用是分解無機磷化物，如磷酸鈣、磷灰石等，其作用機理是借助細菌生命活動過程中所產生的酸溶解無機磷;解有機磷細菌的主要作用是分解有機磷化物，如核酸、磷脂等，其作用機理主要是借助于細菌生命活動中所產生的酶分解有機磷。將解磷細菌作為肥料施入土壤，通過其生長代謝可以在作物根際形成一個磷供應較充分的環境，改善作物磷的供應［5］，增加作物磷吸收量，提高作物產量［6］;另外可以增進土壤肥力、增強植物抗病和抗旱能力［7］。固氮細菌可以將空氣中的N2還原為可以被植物吸收利用的NH4，由于共生固氮菌宿主專一，使用范圍較窄，而自生固氮菌不受這些因素的限制，生產和使用都很方便。吲哚乙酸(IAA)在植物體內參與了細胞伸長生長、形成層細胞分裂、維管組織分化、葉片和花的脫落等許多生理生化過程的調節與控制，對植物的頂端優勢、向性、同化物的運輸等也有調節作用。IAA的生理作用主要依賴于其在植物細胞內的合成、代謝，并通過不同的信號傳導途徑激發各種生理效應［8］。

目前，國內外對解磷、固氮菌和產吲哚乙酸菌的研究涉及諸多方面，但主要集中在菌株的篩選，以及菌株代謝產物的提取、分離、純化和菌株功能的測定方法上，而解磷、固氮和產吲哚乙酸對植物株高及產量的影響，以及兩者之間關系上的報道很少，而且不夠系統和充分。本試驗選擇分離自4種不同生境的菌株，通過大量平板活性測定試驗和對不同植物的溫室促生試驗，尋找解磷、固氮及產吲哚乙酸活性與菌株來源地、溫室促生效果三者之間的相互關系，為以后開發固氮、解磷、產吲哚乙酸微生物肥料提供菌株篩選上的理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌株、作物品種及培養基

供試菌株:南京農業大學植物保護學院生物源農藥研發及農作物疾病綠色防控實驗室保存的分別分離自水稻田、辣椒田、番茄田不同生境及廬山土壤的1 539株細菌菌株。供試作物品種:86優8號(水稻)、蘇椒五號(辣椒)、上海番茄908(番茄)。

LB培養基(1L):胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，補足水至 1 L，用 1 mol/L NaOH 調節pH值至7.0～7.2;固體培養基:在以上成分基礎上加入12 g瓊脂粉。分裝后1×105Pa滅菌20 min，備用。

蒙金娜無機磷培養基(NPA):葡萄糖 10.0 g、(NH4)2SO40.50 g、NaCl 0.30 g、KCl 0.30 g、MgSO4·7H2O 0.30 g、FeSO4· 7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、Ca3(PO4)25.00 g、瓊脂 18 g，用水定容至1 L，pH 7.0～7.2;蒙金娜有機磷培養基(OPA):葡萄糖 10.0 g、(NH4)2SO40.50 g、NaCl 0.30 g、KCl 0.30g、MgSO4· 7H2O 0.30g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、卵磷脂0.2 g、CaCO31.0 g、酵母粉 0.50 g、瓊脂 18 g，用水定容至1 L，pH 7.0 ～7.2［9］。

固氮培養基(NFB):蘋果酸5.0 g，MgSO4·7H2O 0.20 g、NaCl 0.10 g、CaCl20.02 g，溴百里香酚藍溶液 2 ml(0.5%，溶于0.2 mol/L KOH)、維生素溶液1 ml(維生素H 0.1 mg/ml，吡哆醇-HCl 0.2 mg/ml)、微量元素溶液 2 ml(CuSO40.4 g/L、ZnSO4·7H2O 0.12 g/L、H3BO41.4 g/L、Na2MoO4·2H2O 1.0 g/L、MgSO4·H2O 1.5 g/L)、1.64%Fe-EDTA 4 ml、KOH 4.5 g、K2HPO40.5 g、瓊脂 15 ～18 g，pH 6.8;無氮培養基(JNFB):蘋果酸 5.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.1 g、CaCl20.02 g、溴百里香酚藍溶液2 ml(0.5%，溶于0.2 mol/L KOH)、維生素溶液1 ml(維生素H 0.1 mg/ml、吡哆醇-HCl 0.2 mg/ml)、微量元素溶液2 ml(CuSO40.4 g/L、ZnSO4·7H2O 0.12 g/L、H3BO41.4 g/L、Na2MoO4·2H2O 1.0 g/L、MgSO4·H2O 1.5 g/L)、1.64%Fe-EDTA 4 ml、KOH 4.5 g，K2HPO40.6 g、KH2PO41.8 g，瓊脂20 g，pH 5.8［10］。

1.2 解磷固氮及產吲哚乙酸活性的測定

1.2.1 解磷能力測定 將細菌采用點板方法分別接于蒙金娜無機磷培養基(NPA)和蒙金娜有機磷培養基(OPA)上，30℃恒溫培養3 d，觀察并測定透明圈的大小，以檢測磷元素的利用情況。

1.2.2 固氮能力測定 將細菌采用點板方法分別接于固氮培養基(NFB)和無氮培養基(JNFB)上，30℃恒溫培養3 d，觀察并測定藍色暈圈的大小，以檢測氮元素的利用情況。

1.2.3 產吲哚乙酸活性測定 將細菌以1∶100的比率在1%胰蛋白胨水溶液(pH 7.2～7.6)中擴繁，30℃，180 r/min培養24 h。加入顯色液，與對照參比測定紅色深度，以檢測菌株產吲哚乙酸的活性［11-12］。

1.3 水稻、辣椒、番茄的溫室促生試驗

水稻、辣椒、番茄種子催芽48 h(25℃)后，分別移入營養土盆缽中，水稻每盆缽移入20棵苗，辣椒和番茄每個盆缽移入10棵苗，每個處理播種2盆。試驗時，先將活化的菌株接入含100 ml LB培養液的搖瓶中，30℃，200 r/min培養24 h。將菌液稀釋至濃度為1×108CFU/ml，每盆澆入菌液20 ml。40 d后統計植株的地上部分長度、質量和地下部分長度、質量。

1.4 定殖力的測定

1.4.1 Rif50突變體的制備 選取溫室試驗效果較好的菌株，對其定殖能力進行測定。先活化細菌，挑取單菌落于5 ml LB培養液中搖動培養過夜。吸取100 μl菌液涂布于含有50 mg/ml利福平(Rif)的 LB平板上，30℃培養 1～2 d。挑取 LB平板上的單菌落，純化，用80%甘油保存。分別提取野生型菌株和突變體菌株的DNA，進行BOXPCR分析，驗證突變體菌株與野生型菌株是否為同一菌株。

1.4.2 溫室試驗 種子消毒:先用70%乙醇浸種1 min;然后用5.25%NaClO浸種10～15 min;最后用無菌水清洗3～4遍。活化突變菌株，于LB+Rif50的培養液中搖動培養過夜。8 000 r/min離心10 min，收集菌體。用無菌水懸浮菌體制備菌懸液，濃度為1×108CFU/ml。把經過消毒的辣椒種子在菌懸液中浸泡30 min，后點播于裝有營養土的盆中。根據辣椒生長期，定量檢測辣椒的帶菌量。于播種后7 d、14 d、21 d、30 d 對菌株的定殖能力進行測定。具體方法為:稱取1 g根，將其剪碎后置于研缽中，加入2 ml 0.85%的生理鹽水輕輕研磨;靜止30 min后吸取0.1 ml研磨液，加入0.9 ml無菌生理鹽水，混合均勻并進行梯度稀釋;取適當稀釋梯度的稀釋溶液各100 μl均勻涂布于含有Rif50的LB平板上，30℃培養1～2 d;根據平板上的菌落數，確定細菌在植物根圍的定殖情況。并將回收到的菌株與野生型菌株進行BOX-PCR分析。

1.5 大田試驗

選取在溫室試驗中表現良好的菌株在江蘇省泗洪縣進行大田試驗。試驗采用隨機區組設計，每個處理設2個重復，不同處理間設1個隔離行。采取灌根處理，在辣椒移栽時，每株辣椒澆濃度為1×108CFU/ml的菌液10 ml。45 d后進行田間調查，隨即選取200株測定辣椒的株高、質量。

1.6 數據分析

采用Excel 2003和SPSS for Window 13.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 解磷、固氮及產吲哚乙酸菌株的篩選

通過對1 539株分離自番茄田、辣椒田、水稻田和廬山土等4個不同環境的菌株進行解磷能力、固氮能力和產吲哚乙酸活性測定，篩選到了276株細菌菌株。其中，單獨具有解磷、固氮及產吲哚乙酸活性的菌株分別有10株、22株及24株;具有解磷和固氮、解磷和產吲哚乙酸以及固氮和產吲哚乙酸活性的菌株分別有17株、36株及46株;同時具有解磷、固氮和產吲哚乙酸3種活性的菌株有121株。根據菌株來源進行分類，來自番茄田的菌株為70株，辣椒田60株，水稻田86株，廬山土60株。

2.2 溫室試驗結果

對通過平板活性試驗篩選出的276株細菌進行水稻、番茄和辣椒上的溫室促生試驗。通過溫室試驗，篩選出了具有溫室促生效果的菌株134株，其中解磷菌株9株，固氮菌株14株，產吲哚酸菌株14株，解磷+固氮菌株15株，解磷+產吲哚酸菌株20株，固氮+產吲哚酸菌株20株，解磷+固氮+產吲哚酸菌株42株。

2.3 解磷、固氮、產吲哚乙酸與水稻、辣椒、番茄促生效果間相關性分析

如圖1～7所示，具有解磷、固氮、產吲哚乙酸活性的菌株，其平板活性與其對植物的促生作用呈正相關，即平板活性越強的菌株，對植物的促生效果越明顯，植物生物量的增加越顯著。

圖1 菌株解磷活性與番茄生物量增加的關系Fig.1 The relationship between phosphorus solubilization of strains and tomato biomass gain

圖2 菌株固氮活性與番茄生物量增加的關系Fig.2 The relationship between nitrogen fixation of strains and tomato biomass gain

圖3 菌株產吲哚乙酸活性與番茄生物量增加的關系Fig.3 The relationship between IAA production of strains and tomato biomass gain

圖4 菌株解磷+固氮活性與番茄生物量增加的關系Fig.4 The relationship between phosphorus solubilization +nitrogen fixation of strains and tomato biomass gain

圖5 菌株解磷+產吲哚乙酸活性與水稻生物量增加的關系Fig.5 The relationship between phosphorus solubilization+ IAA production of strains and rice biomass gain

根據菌株具有的活性不同對菌株分類后再進行分析，發現同時具有解磷、固氮及產吲哚乙酸活性的菌株對番茄、辣椒和水稻的平均生物量分別增加48.83%、42.80%和17.45%，顯著高于只具有1種或2種平板活性菌株的促生效果。在具有2種活性的菌株中，具有解磷+固氮活性的菌株效果最好，對番茄、辣椒和水稻的平均生物量分別增加26.83%、33.83%和8.92%。在只具有1種活性的菌株中，具有解磷和固氮活性的菌株促生能力相當，而具產吲哚乙酸活性的菌株促生效果顯著低于前兩者，對番茄、辣椒和水稻的平均生物量分別只增加9.90%、8.60%和2.44%(表1)。

表1 解磷、固氮、產吲哚乙酸菌株對番茄、辣椒、水稻的促生效果Table 1 The promotive effect of the stains with phosphorus solubilization，nitrogen fixation，and IAA production on tomato，pepper and rice

對于同時具有解磷、固氮及產吲哚乙酸3種活性的菌株，對其活性進行賦值，并對賦值與植株生物量增加值進行相關性分析。結果顯示，賦值與番茄株高和植株質量增加值的相關系數分別為0.886(P=0)和 0.619(P=0)，辣椒分別為0.872(P=0)和0.616(P=0.006)，水稻分別為0.726(P=0)和0.539(P=0.028)，說明菌株的解磷、固氮及產吲哚乙酸活性與植物生物量的增加存在較強的正相關。

圖6 菌株固氮+產吲哚乙酸活性與番茄生物量增加的關系Fig.6 The relationship between nitrogen fixation+IAA production of strains and tomato biomass gain

圖7 菌株解磷+固氮+產吲哚乙酸活性與番茄生物量增加的關系Fig.7 The relationship between phosphorus solubilization+nitrogen fixation+IAA production of strains and tomato biomass gain

2.4 不同來源的菌株對水稻、辣椒、番茄促生效果

把具有活性的菌株根據來源地不同進行分類后分析，結果(表2)顯示，來自番茄田的菌株對番茄、辣椒和水稻均有較好的促生效果，其次是來自水稻田的菌株。從促生作用與菌株來源相關性看，來自番茄田的菌株對番茄的促生效果最好，番茄株高和植株質量分別增加24.09%和36.92%。來自水稻田的菌株對水稻的促生效果僅次于來自番茄田的菌株，但差異并不顯著。而來自辣椒田的菌株對辣椒的促生效果不如來自番茄田、水稻田、廬山土的菌株。

表2 不同菌株來源對作物的促生效果Table 2 The relationship between strains source and plant growth promotion

2.5 優勢菌株的定殖力

對在溫室試驗中表現效果較好的18株菌進行定殖力測定。結果(表3)顯示，菌株R112.11在定殖21 d后，仍能在植物根部檢測到較高濃度的定殖量，定殖量為2.53×103CFU/g。菌株 12LY027在定殖21 d達到最高值(1.98×103CFU/g)。菌株12LY101在定殖 14 d達到最高值，為1.89×103CFU/g。而菌株12LR73、2SES4、7ZE16并沒有表現出定殖能力。劉慶豐等［13］報道枯草芽胞桿菌XF-1對大白菜根腫病具有良好防治效果，其定殖能力較強，接種大白菜60 d后，根圍和根表定殖密度仍能穩定在103CFU/g。黎起秦等［14］的研究結果表明枯草芽孢桿菌B47在番茄植株根和莖中定殖量達到104CFU/g的時候，對番茄青枯病的防治效果能夠達到79.79%。

2.6 優勢菌株對大田辣椒的促生效果

在江蘇省泗洪縣現代農業示范園進行了18株優勢菌株對辣椒促生效果的大田試驗。結果(表3)表明，菌株 12LY101、12LY027、R112.11 處理的辣椒苗期生物量顯著高于對照，分別增長了57%、37%和31%，株高分別增加了13%、11%和22%。其他菌株對苗期辣椒也有一定的促生效果，但與對照的差異并不顯著。

表3 優勢菌株的溫室定殖力及對大田辣椒的促生效果Table 3 Colonization of dominant strains in greenhouse and their promotions on pepper

3 討論

目前，國內外對植物根際促生菌的報道較多［15-18］。本試驗主要從解磷能力、固氮能力和產IAA能力這3個特性初步說明其促生機理以及它們之間的相關性。

目前研究報道的解磷、固氮微生物主要有細菌、真菌等［19-22］。在試驗中我們發現，單獨具有產吲哚乙酸活性的菌株其促生能力比具有解磷或固氮活性的菌株低，可能有2個原因:①植物在苗期的生長，需要大量的氮、磷，因此解磷、固氮作用就比產吲哚乙酸更重要;②吲哚乙酸作為一種植物生長激素，它對植物的作用需要一定的濃度，濃度太低則促生作用不明顯，濃度太高則抑制植物生長［23］。而本試驗中只是對吲哚乙酸進行了定性分析，沒有做定量測定，不知道其濃度是否適當。已有研究結果表明固氮菌也具有一定的溶磷能力［24］，植物根際促生菌同時具有溶磷和固氮能力，可顯著改善水稻幼苗生長期的氮素和磷素營養［25］，從而達到促進水稻幼苗生長的效果。

綜合分析各菌株對番茄、辣椒和水稻的促生效果，發現菌株對水稻的促生效果顯著低于其他2種作物，這可能與水稻的生長習性有關。番茄和辣椒都是茄科作物，生長習性相似，促生效果也相當。而水稻作為水田生長的植物，其根圍是厭氧環境，而我們使用的菌株大都為需氧細菌，不適宜在厭氧環境下生長。另外，水稻生長所需的營養元素及比例也與番茄、辣椒有所不同。

生防菌株能否在寄主植物根圍以及其他生境穩定定殖是其發揮生防能力的關鍵因素［26-28］。從對植物定殖能力的試驗結果來看，菌株 R112.11、12LY027和12LY101均表現出較好的植物根圍定殖力，而在大田試驗中，這些菌株表現出很好的促生效果。這說明菌株的定殖能力也應該是影響其對植物作用的一個因素［14］。Bull等［29］證明生防菌株 2-79的定殖量與寄主植物病斑數成反比，定殖量越大病斑數量越小，當根部定殖量達到1×107～1×108CFU/cm時，幾乎不產生任何病斑。平板試驗中表現優良的菌株若沒有較好的定殖力，在大田試驗中也無法發揮其潛力。因此，我們在進行菌株篩選時，除了考慮主要活性，還要對菌株的其他性狀進行綜合分析。本試驗通過對不同土壤環境的細菌菌株進行解磷、固氮、產吲哚乙酸活性的分析，評價其在植物促生過中的作用，初步揭示了這些菌株的促生機理，可為以后研制生物肥料提供參考。

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