銅綠微囊藻對培養液氮轉化及微生物功能群的影響

童昊雅， 王愛麗， 余康華， 李 騏， 李文龍， 肖 琳，3

(1.南京大學環境學院，江蘇 南京 210023;2.南京大學匡亞明學院，江蘇 南京 210093;3.污染控制與資源化研究國家重點實驗室，江蘇 南京 210023)

水華是湖泊富營養化的典型表征之一，藍藻水華的形成影響了水生態系統的健康發展。藍藻大量生長改變了水體的理化環境，使水體透明度降低，散發腥臭味，溶解氧減少，并造成魚蝦等水生物的死亡。因此，藍藻水華被認為是影響水質的重要因素之一，此外，它產生的以微囊藻毒素為代表的有毒代謝物，能夠嚴重危害人類身體健康和生命安全。當水體中的營養素被藍藻耗盡時，藍藻大量死亡。死亡的藻體，在被細菌分解過程中還會產生并釋放藍藻毒素，最終導致水生態系統的迅速崩潰［1］。所以，國內外學者對暴發水華的藍藻進行了大量研究，其中，對藍藻優勢種——銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)研究最多。

藍藻水華的暴發首先與外源性營養元素有關，而氮正是藍藻生長所需的最重要的營養元素之一，因此，探究銅綠微囊藻生長周期內各形態氮含量的變化，對于研究藍藻水華的生態影響，控制藍藻水華具有重要意義。而水體氮元素的生物轉化，主要是在微生物驅動下進行的，其主要過程包括氨化、吸收同化作用、硝化和反硝化作用等。對于生物脫氮，除了受溶解氧、pH等因素影響外，參與氮循環過程的幾種微生物種群是制約氮素去除效率的主要因素，例如硝化和亞硝化細菌，它們的世代時間一般為15 h，而一些異養的微生物，它們的世代時間一般為20～40 min，生長緩慢的硝化微生物經常由于對氧氣和營養物質的弱競爭力導致生長不良或被沖刷掉［2-4］。因此研究在藍藻水華暴發過程中，氮轉化微生物功能群群落結構的變化，對尋求有效的生物修復方法具有重要的指導作用。

國內對湖泊生態的研究是比較全面的，但是就藍藻對氮循環的影響研究還不多。湖泊中氮循環相關微生物的群落結構以及遺傳學特性受藍藻水華影響的研究國內現在還未見報道［5］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗使用的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)采用中國科學院武漢水生生物研究所提供的銅綠微囊藻7806，使用培養基BG-11，培養條件為25℃，光暗比12 h/12 h，光照度為 2 200 lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 試驗地點設在南京大學環境學院實驗室。根據預試驗結果，設置處理組如下，取處于對數生長期的銅綠微囊藻，經離心(4 000 r/min，15 min)，洗滌后接種在BG-11培養基中，使體系藻密度達到106CFU/ml，置于光照培養箱中培養。除了處理組之外，另設一組對照組，每組均為3個平行。試驗在2 000 ml大燒杯中進行，初始體系為1 600 ml，時間從2011年10月15日到12月14日，每天測定各體系的pH、氧化還原電位，每周測定所有體系中總氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、氨氮含量及處理體系中藻密度的變化，在試驗開始、中間及結束時用最大可能數法測定水體中反硝化細菌的數量，在試驗開始及結束時用T-RFLP技術對各體系中微生物群落結構進行分析。

1.2.2 pH、氧化還原電位及銅綠微囊藻生長曲線的測定 用便攜式氧化還原電位儀(雷磁PHBJ-260)測定各體系氧化還原電位，用精密 pH計(DENVER UB-7)測定各體系pH，用細胞計數器(Beckman coulter)對處理組藻液進行細胞計數，根據每周藻液藻密度變化，繪制生長曲線。

1.2.3 各形態氮含量的測定 每次取各體系內培養液1 ml，121℃下用堿性過硫酸鉀消解后，用紫外分光光度法測定水體總氮含量。每次取各體系內培養液3 ml，用0.45 μm濾器進行過濾，棄去初濾液1 ml，取剩下的濾液1 ml，用紫外分光光度法測定硝酸鹽氮含量。亞硝酸鹽氮及氨氮含量測定預處理方法同硝酸鹽氮，測試方法分別為N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法及納氏試劑光度法。

1.2.4 反硝化細菌數量的測定 用MPN法測定水樣中的細菌數［6］。配制反硝化細菌液體培養基，每根培養試管(長度150 mm×直徑15 mm)中裝入9 ml培養基，并將小指管(長度30 mm×直徑15 mm)分別倒置在裝有反硝化培養基的每支試管中，加塞，在121℃下滅菌30 min 備用。每個水樣作10－3、10－4、10－53 個10倍系列稀釋，每支試管中接種水樣和稀釋水樣各1 ml，每個稀釋度做5個平行。在(28±1)℃條件下，反硝化細菌培養15 d，定期觀測發酵管內發酵、產氣情況，15 d后以格里斯試劑、二苯胺試劑、硫酸亞鐵試劑等檢測各種形態氮的產生消失情況，查MPN表，用下式計算樣品中細菌數:1 ml(g)樣品中菌數=菌近似值×數量指標第1位數的稀釋倍數，結果取細菌數的常用對數作圖分析［4］。

1.2.5 水體細菌群落結構的測定 在試驗開始后一周及試驗結束時，共2次分別對6個體系進行取樣測定。每個體系取樣200 ml。平行體系在提取DNA后，合并提取物進行分析。

提取總DNA:將200 ml培養藻液過0.45 μm的滅菌濾膜，在液氮中反復凍融3次，用玻璃勻漿器搗碎，樣品加入1.35 ml提取緩沖液［0.1 mol/L PBS(pH 8.0)，0.1 mol/L EDTA，0.1 mol/L Tris base(pH 8.0)，1.5 mol/L NaCl，1.0%CTAB］和 5 μl蛋白酶 K(10 mg/L)，在37℃、225 r/min振蕩30 min后，加入0.15 ml 20%的SDS，然后65℃水浴加熱2 h(每隔15 min輕輕搖動1次)。將上述樣品處理液以10 000 r/min離心10 min后收集上清液，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1，體積比)，混勻，離心5 min，將上清液轉入另一只離心管中，加入1∶1(體積比)的氯仿/異戊醇(24∶1，體積比)抽提上清液，9 000 r/min離心5 min后，在上清液中加入0.6倍體積異丙醇，－20℃沉淀 30 min，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，70%冰乙醇清洗兩次，無菌風吹干，用35 μl TE緩沖液溶解沉淀得到總DNA的提取液，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，結果在 20 000 bp處有條帶，說明提取到總DNA。將提取到的基因組置于－20℃保存備用。

PCR擴增:參考Leser等于2000年發表的細菌16S rDNA通用序列(8-27F:5'-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3';SD-BACT-0926:5'-CCGTCAATTCCTTT RAGTTT-3')設計引物。引物的5'末端用6-FAM熒光標記。PCR反應體系:利用DNA提取物作為模板，PCR 反應總體系為 20.0 μl，內含 5.0 μl 10 × PCR Buffer，4.0 μl dNTPs，上下游引物各 0.2 μl，0.5 μl模板DNA，0.25 μl rTaq酶(TaKaRa公司)。反應條件:95 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30 個循環;最終72℃延伸4 min。反應后，均置于－20℃保存。

PCR反應結果檢測:取5 μl PCR擴增產物進行0.8%瓊脂糖凝電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察拍照。

16S rDNA擴增產物的酶切:利用限制性內切酶HaeⅢ酶切PCR擴增得到的16S rDNA產物，反應總體系為10.0 μl，內含 10 倍緩沖液 1.0 μl，PCR 產物8.5 μl，內切酶 HaeⅢ0.5 μl。在 37 ℃水浴酶切 5 h后置于65℃水浴30 min，酶切產物置于4℃保存。

CEQ-8000遺傳分析儀測定分析:每個反應孔中加入 0.5 μl酶切產物、30 μl上樣緩沖液及 0.5 μl標準分子量，上機檢測。檢測完畢后，通過儀器軟件自動分析數據。

1.3 數據處理及作圖

采用Excel 2010處理數據及作圖，SPSS 17.0進行ANOVA統計分析。

2 結果與分析

2.1 銅綠微囊藻水華對水體理化性質的影響

2.1.1 對水體pH值及氧化還原電位的影響 通過測定體系中銅綠微囊藻密度，得到銅綠微囊藻生長狀況大致如下:1～3周銅綠微囊藻處于穩定期，第4周開始進入快速增長期，5～6周增殖速度減緩，6～7周處于穩定期，7～8周進入衰亡期。

在整個生長過程中，空白水體pH值始終低于藻處理。空白水體中pH值，基本維持在最初的水平(7.1左右);而接種銅綠微囊藻的體系中，pH值先升高后下降。這是由于藻類在對數生長期光合作用較強烈，不斷消耗水體中的CO2及HCO3－，導致水體的酸性下降，pH值升高，最初會升高至10左右，進入穩定期和衰亡期后，銅綠微囊藻光合作用減弱而呼吸作用加強，產生的CO2溶于水中，pH值有所下降，最終維持在8左右。有研究表明，水體pH值高有利于銅綠微囊藻的生長［7-8］，而微囊藻的生長又使水體pH值進一步上升，水體pH的變化與微囊藻藻密度的變化是它們交互作用的結果，互為因果關系［9］。

試驗周期中，空白水體氧化還原電位始終高于藻處理。大量的銅綠微囊藻會使水體中溶解氧含量降低，氧化還原電位隨之降低，從而改變藻類的生長環境［10］。有研究表明，低氧化還原條件有利于銅綠微囊藻體內多聚磷的積累，增強其對不適條件的抵抗能力［11］，并且低氧化還原條件可以提高銅綠微囊藻的細胞分裂速度，提高其生長速率［12］。

2.1.2 對水體氮轉化的影響

2.1.2.1 對水體總氮含量的影響 在試驗周期中，空白水體總氮含量大致守恒，始終保持在初始值250 mg/L左右(圖1)。在開始3周，藻處理總氮含量略高于空白水體，但差異不顯著，微小的差異可能是由加入體系中的銅綠微囊藻帶來的。在第4周，銅綠微囊藻進入快速增長期，藻處理的總氮含量在一周內有了非常明顯的下降，與空白處理出現了極顯著性差異(P＜0.01)，這種差異一直持續到試驗周期結束，可能是由于銅綠微囊藻的大量增殖為反硝化細菌的生長提供了有利條件，反硝化作用有了較大程度的增長。在之后幾周，藻處理的總氮含量略有下降但是下降不再明顯，這可能是由于此時硝化反硝化作用以及藻的同化作用處于一個相對平衡的狀態，反硝化作用略強于硝化作用及藻同化作用的總和。最終含藻培養液的總氮含量從最初的261 mg/L下降到了166 mg/L，減少了36.40%，說明試驗過程中，一部分NOx通過反硝化作用轉化為氮氣排出體系外，一定程度上削減了體系中的氮營養鹽含量。

圖1 水體中總氮含量變化Fig.1 Variation of total nitrogen content in different water bodies

2.1.2.2 對水體NOx含量的影響 所有體系中，氮均以NOx為主要存在形式，自始至終占體系總氮量的50%以上。在空白水體中，NOx量始終占總氮量的80%以上。而在藻處理中，由于藻團的微環境為氮轉化細菌尤其是反硝化細菌提供了有利的生長環境，所以出現了如下的變化:1～3周，NOx含量占總氮含量的80%以上;在銅綠微囊藻進入快速增長期即第4周后，NOx比例下降(圖2)，這可能是由銅綠微囊藻的同化作用及水體中微生物的反硝化作用增強所導致的，在增長速度最快的第4周，NOx含量占總氮含量＜70%，此時藻處理的NOx含量與空白出現極顯著性差異(P＜0.01)，這種差異一直持續到試驗周期結束;在銅綠微囊藻增長速度放緩及之后的穩定期、衰亡期中，NOx含量比例有所上升，這可能是因為藻細胞出現衰亡，細胞破裂釋放出一定量的氮元素所導致，最終NOx含量穩定在75%左右。在整個試驗周期中，所有體系中的NO3－與總氮變化趨勢均類似，說明總氮的去除主要是由于硝態氮的反硝化作用引起的。而NO2－含量在空白水體中變化不大;但是在藻處理中，NO2－含量先快速上升，而后下降，這是由于培養液中存在反硝化作用，銅綠微囊藻在光照條件下進行光合作用產生氧氣，在黑暗條件下進行呼吸作用消耗氧氣造成藻處理氧化還原電位較低，有利于反硝化作用的進行。

圖2 水體中NOx含量變化Fig.2 Variation of NOxcontent in different water bodies

2.1.2.3 對水體氨態氮含量的影響 空白水體與藻處理的氨態氮含量及變化趨勢都較為相近，隨時間的推移緩慢升高(圖3)。有研究表明，總氮的降解有一部分是通過氨態氮的遷移轉化進行的［13］。氨態氮含量隨時間不斷升高，空白水體中可能來源于總氮的降解;藻處理中可能一部分來源于總氮的降解，另一部分來源于藻類殘骸的分解釋放，導致藻處理的氨態氮含量在后期略高于空白水體。

圖3 水體中氨態氮含量變化Fig.3 Variation of ammonia nitrogen content in different water bodies

2.2 銅綠微囊藻對水體氮轉化微生物功能群的影響

2.2.1 對反硝化細菌數量的影響 用MPN法測定水體中反硝化細菌數量，結果表明，空白水體中反硝化細菌數生長緩慢，試驗結束時不超過5×104CFU/ml;而藻處理中反硝化細菌數生長很快，試驗結束時約為1.5×105CFU/ml。說明接入銅綠微囊藻后，銅綠微囊藻為反硝化細菌的生長提供了有利的生長環境，反硝化細菌數量較空白對照明顯增多，能夠加快水體氮素的釋放，從而改善水體的富營養化及水體的生態狀況。

2.2.2 對微生物群落結構的影響 由于試驗所用培養水體為滅菌培養基，且采用密閉培養，所以即使在試驗開始1周后進行測定，空白水體中細菌仍非常少，未能擴增到有效結果，因此僅討論試驗開始時的藻處理、試驗結束時的空白水體及藻處理3個樣品結果。根據HaeⅢ酶切T-RFLP圖譜(圖4)末端限制性片段數目及相對峰高值，分別計算物種豐度、多樣性指數及物種均度(表1)［14］。

圖4 不同水體中微生物的相對豐度Fig.4 Relative richness of microbe in different water bodies

表1 基于T-RFLP圖譜的微生物多樣性分析Table 1 Analysis of microbial diversity based on T-RFLP profiles

根據T-RFLP圖譜(圖4)，空白水體中的限制性片段主要是131 bp和185 bp，大約占65%;藻處理在試驗開始時185 bp和216 bp占大多數，大約占60%，而在試驗結束時則主要是131 bp、185 bp、193 bp、390 bp，大約占46%。其中216 bp在空白培養液中未出現，說明它為藻團本身攜帶的細菌，藻團可以為其生長提供有利條件。

根據表1，從不同樣品的微生物多樣性指數來看，經過一個試驗周期，空白水體及藻處理的物種多樣性都有上升，但是藻處理的物種多樣性仍然更豐富。從樣品的物種均一度來看，相比空白水體，藻處理的物種豐度相差不明顯，較少存在占據絕對優勢地位的微生物物種;而在空白培養液中，存在一定數量的占據相對優勢的物種。以上結果說明銅綠微囊藻的存在能夠為多種細菌提供更有利的生長環境，進一步提高生態系統物種的豐度及物種的均一性，從而提高生態系統的穩定性，為生態系統的自我修復創造有利條件。

對3個樣品中的主要限制性片段進行定性分析:主要有 185 bp、131 bp、193 bp、216 bp、228 bp、231 bp、390 bp、293 bp 及 296 bp。這些片段代表了樣品中的優勢微生物。查詢文庫，結果如表2所示。

表2 限制性片段的定性分析Table 2 Qualitative analysis of terminal restriction fragment

185 bp代表的為微胞藻屬(Microcystis)，在本次試驗中，即為銅綠微囊藻;131 bp、231 bp、390 bp代表的均為浮霉菌門(Planctomycetes)下的微生物;228 bp代表的為放線菌門(Actinobacteria)下的微生物;193 bp、293 bp、296 bp代表的為α變形菌門(Alphaproteobacteria)下的微生物，216 bp則代表β變形菌門(Betaproteobacteria)下的微生物。可以看出，藻處理組較空白水體而言，有更多的放線菌門、α變形菌門及β變形菌門微生物。有研究表明，α變形菌及β變形菌能夠附著在有機聚合物上，通過連續的群落演替釋放氨基酸［15］。另外，在研究水華暴發的過程中也發現，一些α變形菌能夠附生在顆粒物上，并具有較快的生長速率和較高的酶活性［16］。所以，藻處理與空白水體的差異，可能是由于銅綠微囊藻造成體系氧化還原電位下降從而形成厭氧環境、聚集的藻體為細菌提供有利的附生場所造成的。

3 結論

試驗結果表明，銅綠微囊藻的存在能夠極大地提高水體細菌種類的豐度，同時加快水體中的反硝化作用，促進水體中氮素的釋放，從而穩定水體生態系統，加快水體生態的自我修復。從各形態氮含量來看，處理的總氮含量、硝酸鹽氮含量較之空白而言均有所降低，而亞硝酸鹽氮處理中則有所增高。反硝化細菌數量在處理中較空白中有明顯增多，銅綠微囊藻藻團有利于創造厭氧-需氧的環境，使得反硝化細菌更易在其中繁殖生長。

本試驗處理時間相對較短，而研究富營養化水體中各種氮循環菌分布的長期變化是必要的，這可以有助于了解它們對氮循環所起作用的規律性。并且本次試驗所用水體為實驗室配制培養基，所用藻種也為實驗室培養藻種，將實驗室結論推廣到自然生態系統中還需要進行進一步的取樣論證或實地考察，才能為實際應用提供更加直接的理論依據。

致謝: 本研究得到了肖琳教授的精心指導和幫助，特此致謝!

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