蒙古綿羊輸卵管組織中 β-防御素表達的原位雜交技術檢測

錫林高娃， 任洪寶， 曹貴方

(1.內蒙古民族大學生命科學學院，內蒙古 通遼 028400;2.內蒙古民族大學乳源性致病菌研究所，內蒙古 通遼 028400;3.內蒙古農業大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

病原微生物最初在動物機體上皮、黏膜表面增殖、入侵，由于病原特異性免疫反應相對滯后，機體必須在上皮表面對微生物進行有效殺滅，即產生非特異性免疫反應，以防止病原微生物的過量增殖造成更大危害。由于雌性動物生殖道的生理功能，必須運行有效的黏膜屏障使得精子通過，同時阻止有害微生物進入子宮及輸卵管，所以非特異性免疫對于雌性生殖道至關重要。β－防御素作為來自機體自身的內源性抗菌肽，廣泛存在于動物機體內，參與生物體非特異性免疫反應，具有較強的廣譜殺菌功能［1-2］。為闡明蒙古綿羊β-防御素(Sheep beta-defensin，sBD-1)在輸卵管組織內的表達定位，本研究擬以擴增的sBD-1 cDNA作為探針，采用RNA原位雜交技術進行檢測，旨在為進一步研究sBD-1在蒙古綿羊生殖系統非特異性免疫防御機制提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物及其組織

5只健康狀況良好的成年蒙古綿羊由呼和浩特市回民屠宰場提供。取輸卵管組織固定，HE染色，在含0.1%DEPC的4%多聚甲醛中固定4 h，然后于無RNA酶條件下進行石蠟包埋。其余迅速取樣后液氮凍存。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒(Cat.NO.Z5110)購自Promega公司;RT-PCR 試劑盒(Cat.NO.DRR019A)購自大連寶生物工程公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Cat.NO.DP208/209)購自南京博爾迪公司;地高辛探針標記和檢測試劑盒(Cat.NO.11745832910)購自 Roche 公司;DEPC、EDTA、Tris-HCl、吐溫20、硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、去離子甲酰胺、鮭魚精DNA、多聚賴氨酸、蛋白酶K、雜交專用蓋玻片、尼龍膜等購自Sigma公司;融蠟箱、恒溫箱、切片機及馬來酸等常規試劑為本實驗室提供。

1.3 方法

1.3.1 sBD-1核酸探針的合成 根據羊 β-防御素cDNA序列(GenBank登錄號:U75250)設計引物(擴增產物大小為300 bp左右)P1(5'-GCCAACATGAGGCTCCATCACCTGCTCCT-3')和P2(5'-AACTTTGAACAAAATTTATTCTGGTTTAAATT-3')。提取輸卵管組織總RNA并反轉錄成cDNA，RT-PCR擴增并回收測序驗證擴增序列的真實性。對回收產物進行地高辛標記，并根據地高辛標記產物達到預期效率的測定方法對本標記產物進行測定。對比Control DNA(試劑盒提供)和地高辛標記產物形成的斑點，如果稀釋為0.1 pg的斑點即第5個斑點可見，那么地高辛標記產物達到了預期的效率，可做雜交。

1.3.2 切片制備和雜交 將固定好的輸卵管組織切片，貼于用多聚賴氨酸預處理的載玻片上，60℃干烤1 h。烘烤后的切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精下行至無RNase水，空氣干燥約10 min;切片浸入含50 μg/ml蛋白酶K的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)中，37℃ 消化6～7 min;PBS洗2次，4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS中固定1.5 min;PBS洗2次，干燥。每張切片滴加30 μl預雜交液(5×SSC，5×Denhardt，50%去離子甲酰胺，1%SDS，250 μg/ml鮭魚精DNA)，42 ℃預雜交1 h;輕輕傾去預雜交液，每張切片再滴加20 μl雜交液(5×SSC，5 ×Denhardt，50% 去離子甲酰胺，1%SDS，250 μg/ml鮭魚精DNA，10%硫酸葡聚糖，1 μl雜交液中加入3 ng sBD-1 cDNA反義探針)，蓋上雜交專用蓋玻片，42℃雜交20 h。2×SSC中振蕩去掉蓋玻片，切片順次經2×SSC、1×SSC、0.25×SSC中室溫各2×15 min;每張切片滴加30 μl封閉液，于濕盒內室溫下作用30 min;輕輕傾去封閉液，每張切片滴加30 μl 1∶5 000抗地高辛AP液(Anti-DIG-AP)，濕盒內室溫2 h;切片在馬來酸緩沖液(0.1 mol/L馬來酸，0.15 mol/L NaCl，pH 7.5)中室溫2×15 min，在顯色緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，pH 9.5)中室溫10 min;每張切片滴加30 μl 1∶50的NBT/BCIP顯色液，濕盒內避光顯色6 h;滅菌水終止顯色反應，伊紅復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，鏡下觀察，照相。陰性對照試驗:雜交液中不加探針，其余步驟同上。

2 結果

將RT-PCR產物回收經電泳檢測，條帶單一，大小為301 bp，且cDNA含量為5 ng/μl，可用于探針制備。產物經地高辛標記，0.1 pg斑點已經顯藍色，說明標記的探針已達到預期量1 000 ng，可做雜交試驗。

檢測蒙古綿羊輸卵管組織中sBD-1 mRNA在組織細胞內的表達情況，結果顯示，應用sBD-1 cDNA地高辛標記的探針雜交，在輸卵管上皮近管腔的游離面胞質內有非常強的藍紫色的雜交信號(圖1A和圖1B)，而陰性對照無雜交信號(圖1C和圖1D)。如圖1所示，sBD-1 mRNA的雜交信號主要位于輸卵管黏膜層上皮細胞胞質的游離端內;肌層、外膜、固有層內均無雜交信號。這說明輸卵管黏膜層上皮細胞的胞質內是表達sBD-1 mRNA的場所，而固有層、肌層、結締組織等均不表達。

圖1 蒙古綿羊輸卵管上皮細胞原位雜交結果Fig.1 The expression of β-defensin in fallopiantube of Mongolian sheep by in situ hybridization

3 討論

β-防御素作為一類大量存在于哺乳動物上皮組織內的內源性抗微生物肽，參與生物體天然免疫和獲得性免疫，具有較強的廣譜殺菌功能，且迄今為止尚未發現病原菌對它產生耐藥性。鑒于國內外對于反芻動物雌性生殖道β-防御素研究比較缺乏，本研究檢測其在輸卵管組織內的表達定位，對于了解反芻動物妊娠期間防御素表達調控的基本規律及在機體防御功能方面的作用均具有重大意義。

起初，哺乳動物防御素被認為是只存在于造血細胞起源的細胞內，后來相繼在人和鼠的小腸潘氏細胞內、牛舌和豬舌、腸道和氣管的黏膜上皮內發現有防御素mRNA的表達［3-5］。對于綿羊雌性生殖道內的β-防御素(sBD-1)，目前鮮見相關研究報道。雌性生殖系統內的防御素的研究目前主要集中在人防御素(hBD1-3)及鼠防御素(rBD-1，rBD-2)上。Pivarcsi等研究發現，體外培養的人陰道上皮細胞能夠分泌對抗病原菌感染的hBD-2［6］。Valore等通過原位雜交定位，HBD-1 mRNA在腎臟Henle環、遠端小管、收集管的上皮層內表達，在雌性生殖道的輸卵管、子宮、子宮頸、陰道的上皮層表達，并對大腸埃希菌等微生物均有殺滅作用，提出HBD-1是女性泌尿生殖道重要的先天免疫防御因子，對泌尿生殖道局部抗菌防御起重要作用［7］。King等通過RT-PCR技術研究發現，人子宮內膜作為先天免疫的重要場所，分泌hBD1-4、WAP蛋白對抗外源菌的侵襲從而保護機體［8］。通過RTPCR技術檢測到，鼠β-防御素存在于雌性生殖道的上皮細胞內，并且起抗菌作用。陳新年等證實大鼠β－防御素基因(rBD-1，rBD-2)在皮膚、腎臟、肺臟、子宮頸等均有表達［9］。本試驗通過原位雜交方法定位研究，發現在蒙古綿羊輸卵管黏膜層的上皮細胞游離面的胞質內存在sBD-1表達，符合β-防御素主要表達于黏膜表面細胞的一般規律。

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