一氧化氮對萵苣種子萌發過程中部分物質代謝的影響

楊北寧， 張鳳芝， 蘇國興

(蘇州大學基礎醫學部基礎醫學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123)

迄今為止，已有大量有關一氧化氮(NO)促進植物種子萌發的報道［1］。Kopyra等在羽扇豆(Lupinus luteus)中發現，一定濃度的NO供體硝普鈉(SNP)可提高種子萌發率，作用效果與時間有關，48 h后SNP這種促進萌發作用消失［2］。Lamatine等報道，在26℃條件下，SNP能夠明顯地促進處于暗處的萵苣種子萌發，而用NO清除劑cPTIO處理則可降低對萌發的促進作用［3］。外源添加一定濃度SNP可明顯提高豌豆、黃瓜、玉米和刺槐種子的發芽率［4］。Sarath等證實，NO供體SNP、亞鐵氰化鉀和CN－同樣可促進2種溫季牧草種子的萌發，并可被NO清除劑cPTIO抑制，而認定在該種子萌發過程中有NO的產生［5］。近年來，隨著NO在植物種子萌發和休眠中所起作用的確定，人們相繼展開了NO促進種子萌發和解除休眠的機理研究。如在擬南芥種子萌發過程中，證實NO的作用部位是糊粉層。在NO外源供體SNP誘導小麥種子萌發的研究中，發現種子的β-淀粉酶基因轉錄水平和β-淀粉酶活性受到SNP的促進［6］。然而，經NO和NO合成抑制劑處理后，在種子萌發過程中，種子內貯藏物質含量的變化仍鮮見報道。本研究以萵苣種子為材料，研究NO供體硝普鈉(SNP)和NO生物合成抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)對萵苣種子萌發時內含物質含量和水解酶活性的影響，為NO供體促進萵苣種子萌發時物質代謝變化的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

萵苣(Lactuca sativa L.)品種掛絲紅種子購于四川省綿陽市種都種業有限公司。所有藥品均購自Sigma公司。

萵苣種子先用0.5%的HgCl2消毒5 min，再用無菌水沖洗5次后，在22℃黑暗環境中用處理液浸種4 h，處理液濃度如下:(1)0 mmol/L(對照)、0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.20 mmol/L NO 供體 SNP;(2)1.00 mmol/L NO生物合成抑制劑L-NAME，所有處理液pH 5.8。選取飽滿的種子播種于含0.5%瓊脂的固體培養基上，22℃暗培養。每個處理組設3個重復。

1.2 測定方法

用目測法(胚根突破種皮大于1 mm)測定0 mmol/L、0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.20 mmol/L SNP處理48 h萵苣種子的萌發率及0 mmol/L、0.10 mmol/L SNP和1.00 mmol/L L-NAME分別處理12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 萵苣種子的種子萌發率。測定0 mmol/L、0.10 mmol/L SNP 和 1.00 mmol/L LNAME 分別處理12 h、24 h、36 h、48 h 萵苣種子內含物質含量和水解酶活性:粗脂肪索氏提取法測定粗脂肪含量［7］;蒽酮比色法測定可溶性糖和淀粉含量［8］;考馬斯亮藍 G250 法測定蛋白質含量［8］;3，5-二硝基水楊酸比色法測定α-淀粉酶和β-淀粉酶活性［8］;堿式滴定法測定脂肪酶活性［9］;磺胺法測定硝酸還原酶活性［10］。

1.3 統計分析

使用SPSS 11.5軟件進行數據統計，用Duncan’s法比較差異顯著性。應用EXCEL軟件進行作圖。

2 結果

2.1 不同濃度硝普鈉(SNP)對萵苣種子萌發的影響

用不同濃度SNP處理萵苣種子36 h，種子的萌發率如圖1所示。SNP對萵苣種子的萌發表現出顯著的促進作用，在0～0.10 mmol/L濃度范圍內，種子萌發率隨SNP濃度的增加而升高，當SNP濃度為0.10 mmol/L時，種子萌發率最高;而當SNP的濃度增至0.20 mmol/L時，種子萌發受到明顯抑制。表明0.10 mmol/L SNP促進萵苣種子萌發的效果最佳。

圖1 不同濃度硝普鈉對萵苣種子萌發的影響Fig.1 The effect of different concentrations of SNP on the seed germination of lettuce

2.2 0.10 mmol/L硝普鈉(SNP)和1.00 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)對萵苣種子萌發的影響

在浸種12～36 h，0.10 mmol/L SNP處理對種子萌發的促進作用最為顯著，在浸種處理24 h和36 h時，種子萌發率分別比對照增加26.5個百分點(P＜0.05)和15.5個百分點(P＜0.05)，但浸種處理48 h后這種促進作用逐漸減弱。1.00 mmol/L LNAME浸種則可顯著抑制種子的萌發，在浸種36 h時，萌發率僅28.1%(圖2)。

圖2 0.10 mmol/L 硝普鈉和 1.00 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯對萵苣種子萌發的影響Fig.2 The effect of 0.10 mmol/L SNP and 1.00 mmol/L LNAME on the seed germination of lettuce

2.3 硝普鈉(SNP)和 N-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)對萵苣種子萌發過程中內含物質含量的影響

如表1所示，0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的粗脂肪含量和蛋白質含量均隨著處理時間的延長而逐漸下降，與0 mmol/L SNP處理(對照)相比，差異均不顯著(P＞0.05));0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的淀粉含量隨著處理時間的延長而逐漸下降，均顯著低于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05);0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的可溶性糖含量隨著處理時間的延長而逐漸增加，均顯著高于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05)。

表1 0.10 mmol/L SNP對萵苣種子萌發過程中內含物質含量的影響Table 1 The effects of 0.10 mmol/L SNP on some substance contents of lettuce during seed germination

如表2所示，1.00 mmol/L L-NAME處理下萵苣種子的蛋白質含量隨著處理時間的延長而逐漸下降，與0 mmol/L SNP處理(對照)相比，差異均不顯著(P＞0.05);1.00 mmol/L L-NAME處理下萵苣種子的粗脂肪含量隨著處理時間的延長而逐漸下降，處理36 h和48 h的粗脂肪含量均顯著高于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05);1.00 mmol/L L-NAME處理下萵苣種子的淀粉含量隨著處理時間的延長而逐漸下降，均顯著高于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05);0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的可溶性糖含量隨著處理時間的延長而逐漸增加，均顯著低于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05)。

表2 1.00 mmol/L L-NAME對萵苣種子萌發過程中內含物質含量的影響Table 2 The effects of 1.00 mmol/L L-NAME on some substance contents during lettuce seed germination

2.4 硝普鈉(SNP)和 N-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)處理后部分水解酶活性的變化

如圖3所示，不同處理下萵苣種子萌發過程中α-淀粉酶活性均隨種子處理時間的延長而逐漸增加，其中0.10 mmol/L SNP處理的α-淀粉酶活性顯著高于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05);0 mmol/L SNP處理下β-淀粉酶活性呈現先升高后降低的趨勢，在處理36 h時β-淀粉酶活性均達到最高峰，0.10 mmol/L SNP處理的β-淀粉酶活性顯著高于0 mmol/L SNP處理(對照)(P＜0.05);不同處理下萵苣種子萌發過程中脂肪水解酶活性均隨種子處理時間的延長而逐漸增加，在浸種12～48 h 0.10 mmol/L SNP處理的種子脂肪水解酶活性均顯著高于0 mmol/L SNP(對照)處理(P＜0.05);不同處理下萵苣種子萌發過程中硝酸還原酶活性均隨種子處理時間的延長而逐漸增加，在浸種12～36 h 0.10 mmol/L SNP處理的種子硝酸還原酶活性均顯著高于0 mmol/L SNP(對照)處理(P＜0.05)。在浸種12～36 h 1.00 mmol/L L-NAME處理的 α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪水解酶、硝酸還原酶的活性均顯著低于0 mmol/L SNP(對照)和0.10 mmol/L SNP處理(P ＜0.05)。

圖3 萵苣種子萌發過程中部分水解酶活性的變化Fig.3 The changes of some hydrolases activities during seed germination of lettuce

3 討論

一氧化氮在植物體的多種生理過程中有重要作用。從本試驗結果來看，0 mmol/L、0.05 mmol/L和0.10 mmol/L硝普鈉(SNP)對萵苣種子的萌發表現出顯著的促進作用，其中0.10 mmol/L硝普鈉的促進作用好于其他2種處理，當SNP濃度上升到0.20 mmol/L時種子萌發受到顯著抑制;在浸種12～36 h，0.10 mmol/L SNP對種子萌發的促進作用最為顯著，48 h后作用消失。這與白旭等［10］關于SNP促進萵苣種子萌發的研究結果相一致。

Bethke等指出，NO促進種子的萌發可能與種子對脫落酸和赤霉素的敏感性改變有關［11］，而ABA和GA與種子水解酶的誘導合成和活性調節有關。孫永剛等在NO外源供體SNP誘導小麥種子萌發的研究中，發現種子的β-淀粉酶基因轉錄水平和β-淀粉酶活性受到SNP的促進［12］，這暗示在種子萌發過程中，種子內含物質的變化會受到NO的影響。在本研究中，我們發現0.10 mmol/L SNP浸種，雖可對種子蛋白質和粗脂肪含量的下降有一定的促進作用，但效果不顯著;而0.10 mmol/LSNP浸種可顯著降低淀粉和增加可溶性糖含量。用抑制種子萌發的NO生物合成抑制劑1.00 mmol/L L-NAME浸種，同樣發現，它們對淀粉降解的抑制作用非常明顯，12 h后便觀察到可溶性糖含量的顯著下降，而1.00 mmol/L L-NAME對種子蛋白質和粗脂肪含量的影響不大。這些結果與孫永剛等［12］的結果相符。

種子萌發過程中內含物質的變化一般與種子內水解酶活性的變化相對應。在本研究中，我們發現0.10 mmol/L SNP處理可顯著增加α-淀粉酶、硝酸還原酶和脂肪水解酶活性;β-淀粉酶活性雖在處理36 h時后呈逐漸下降趨勢，但前期(12～36 h)也明顯受SNP促進。而用1.00 mmol/L L-NAME浸種，種子的α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪水解酶和硝酸還原酶活性均受到抑制。這些結果暗示，NO可能通過調節α-淀粉酶、β-淀粉酶、硝酸還原酶和脂肪酶等水解酶的活性，影響種子體內貯藏物質的降解，進而影響萵苣種子萌發，其中，對淀粉降解和可溶性糖增加的促進作用最為明顯。

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