基于CSSL的水稻苗期耐亞鐵離子脅迫QTL定位

趙春芳， 周麗慧， 丁 丹， 張亞東， 趙慶勇， 于 新， 朱 鎮， 陳 濤， 姚 姝，王才林

(江蘇省農業科學院糧食作物研究所，江蘇省優質水稻工程技術研究中心，國家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京210014)

潛育性水稻土是淹水條件下形成的還原性低產土壤，大面積存在于中國南方稻區。這類稻田由于長期浸水，通氣性差，積累了大量的還原性物質，其中亞鐵離子(Fe2+)被認為是限制水稻生長的最主要物質。水稻遭受Fe2+毒害時，生長發育受到明顯抑制，生物量和產量大幅下降［1］。水稻耐Fe2+毒害遺傳基礎的研究，對利用分子標記輔助選育耐Fe2+毒害的水稻品種、緩解潛育性水稻田的鐵毒危害具有重要意義。

迄今，國內外對水稻耐Fe2+脅迫的遺傳研究已有一些報道［2-10］。Wu 等［2-3］利用 DH 群體，以葉斑指數、鐵離子濃度及抗壞血酸過氧化物酶等一系列酶活性為耐性指標，共檢測到5個耐Fe2+脅迫的QTL，分布于水稻第1、2 和7 染色體上。Wan 等［4，6］利用“Nipponbare/Kasalath”BILs群體，以 Fe2+脅迫下的水稻葉斑指數、地上部和根系干物質重以及分蘗數等性狀為耐性指標，定位到3個QTL，分布于水稻第1和3染色體上。Wan等［5］利用CSSL群體為材料，檢測到14個與耐Fe2+脅迫有關的QTL，分布于水稻第3、6、9、11 和12 染色體上。Wan 等［7］利用F2/F3群體，以溶液培養方式，定位了20個Fe2+脅迫下的葉斑指數、株高和根長等性狀的QTL，分布于水稻10條染色體上。葉紅霞等［9］利用RILs群體定位了4個耐Fe2+脅迫的水稻相對苗高QTL，分別位于第1、3、6 和 9 染色體上。Dufey 等［10］利用 RILs群體定位了24個Fe2+脅迫下控制葉斑指數、干物質重、鐵離子濃度、葉綠素含量等性狀的QTL，分布于水稻第1、2、3、4、7和11染色體上。這些研究結果表明水稻中存在眾多耐Fe2+脅迫基因，不同遺傳群體所含的耐性基因也不盡相同。

水稻耐Fe2+毒害的遺傳基礎復雜，涉及的基因較多，到目前為止人們對其遺傳機制的認識還相當缺乏，尤其是幼苗期的相關研究尚少。本研究利用一套以秈稻品種9311與粳稻品種日本晴雜交后代衍生的遺傳背景為9311的染色體片段置換系(Chromosome segment substitution line，CSSL)為材料，以幼苗耐Fe2+脅迫所表現的相對根長性狀為指標，進行QTL定位分析，以探討水稻耐Fe2+脅迫的遺傳基礎，為分子標記輔助選育耐性品種提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以秈稻品種9311(Oryza sativa L.ssp.indica cv.9311)為受體親本，粳稻品種日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare)為供體親本，得到雜交后代BC4F1。用覆蓋水稻全基因組的親本間具多態性的28對SSR(Simple sequence repeat)引物檢測BC4F1單株的基因型，對于雜合片段在2個及以上的單株予以淘汰，其他無雜合片段或只有1個雜合片段的單株繼續進行檢測。通過篩選，獲得含1個或2個雜合片段的135個單株，繼續種植得到BC4F2群體。每個BC4F2群體中取47株進行基因型檢測，最后獲得119個純合的染色體片段置換系［11］，根據已構建的物理圖譜［12］，計算置換片段在水稻全基因組上的覆蓋率為83.98%。

1.2 溶液培養

試驗于2012年10～11月在江蘇省農業科學院玻璃溫室內進行，室內溫度白天控制在30℃左右，晚上在22℃左右，采用自然光照條件。水稻基本營養液配制參照國際水稻所配方［13］;Fe2+脅迫溶液是在基本營養液中加入FeSO4·7H2O配制成的含250 mg/L Fe2+的溶液。

將119個CSSL及親本稻谷經浸種催芽后播種于底部粘著紗網的泡沫孔板上，每系播種1孔，每孔30粒。將播種的孔板漂浮在裝有15 L自來水的周轉箱中培養3 d，然后在1/2濃度基本營養液和基本營養液中依次各培養5 d。每系及親本選取生長一致的10株幼苗，均分成2份(每份5株)，種植于特制的單苗培養孔板上，分別進行Fe2+脅迫和基本營養液培養，以基本營養液的培養作為對照。每3 d更換1次培養液，每次調節溶液pH=4.5。試驗設置2次重復。

1.3 耐Fe2+脅迫的性狀鑒定

脅迫處理2周后進行性狀調查，分別測量對照和Fe2+脅迫下5株苗的最長根長度。以相對根長性狀來衡量供試材料對Fe2+脅迫的耐性程度。相對根長值用Fe2+脅迫處理下的根長與對照的根長之比表示，即相對根長=Fe2+脅迫處理的根長/對照根長×100%。相對根長值越大，說明受Fe2+毒害越小，表現出更強的耐Fe2+脅迫能力;相對根長值越小，說明受Fe2+毒害越大，表現為對Fe2+脅迫敏感。以2次重復的平均值為統計單元進行數據分析。

1.4 QTL 分析

利用t測驗對相對根長性狀進行差異顯著性分析，檢測各CSSL與受體親本9311之間的差異顯著性，以α=0.01為閾值，即P≤0.01時認為該系所帶的置換片段上有相關QTL存在;否則認為QTL不存在。參照Eshed等［14］的方法檢測各個QTL的加性效應值(Additive effect，AE)及加性效應百分率(Additive effect contribution，AC)，加性效應值 =(CSSL的表型值－9311的表型值)/2，加性效應百分率=(加性效應值/9311的表型值)×100%。

QTL命名遵循McCouch等［15］制定的原則。

1.5 基因型分析和QTL定位

根據已構建的9311為遺傳背景的119個CSSL的物理圖譜，進行染色體片段置換系的基因型分析。QTL作圖參照 Paterson等［16］的方法，如果在含有重疊置換片段的不同CSSL中同時檢測到QTL，且遺傳效應方向一致，則認為該QTL存在于各置換片段的重疊區段上;如果在一個CSSL中檢測到QTL，而在置換片段具有重疊關系的另一CSSL中未被檢測到，則認為該QTL位于兩個置換片段的非重疊區段上。

2 結果

2.1 親本及置換系耐Fe2+脅迫的表型分析

t測驗結果表明受體親本9311和供體親本日本晴的相對根長在2個重復間均未達到顯著差異(P＞0.05)，而在2個重復中兩親本之間的相對根長差異均達到極顯著水平(P＜0.01)。9311的相對根長為(55.74±7.41)%，日本晴的相對根長為(85.22±8.33)%(圖1)，說明日本晴較9311有更強的耐Fe2+脅迫能力。CSSL群體的相對根長值主要集中在50% ～70%，平均值為62.42%，變異范圍為24.20% ～95.53%，表現單峰連續分布，并且出現超親變異(圖1)。可見，該CSSL群體的相對根長性狀存在明顯的遺傳變異，適合于QTL分析。

圖1 Fe2+脅迫下相對根長性狀在CSSL群體中的分布Fig.1 Distribution for relative root length under Fe2+stress in CSSL population

2.2 水稻耐Fe2+脅迫的QTL分析

t測驗結果表明，在119個CSSL中檢測到14個CSSL的相對根長與受體親本9311之間存在極顯著差異(表1)。CSSL117的相對根長值為24.19%，加性效應值為－15.78，加性效應百分率為－28.30%，表現為對Fe2+脅迫敏感。其余13個CSSL的加性效應值均為正，變化范圍為7.63～19.88，加性效應百分率變化范圍為13.69% ～35.66%，表現為較9311更強的耐Fe2+脅迫能力。根據已構建的物理圖譜［12］，對14個CSSL進行基因型分析，發現日本晴置換片段分布于水稻第2、5、6、7和12染色體上(圖2)。利用代換作圖方法，共檢測出9個 QTL，分別為 qRRL2-1、qRRL2-2、qRRL2-3、qRRL5、qRRL6-1、qRRL6-2、qRRL6-3、qRRL7和qRRL12。其中qRRL12的加性效應值為負，效應來源于9311的等位基因;其余8個QTL的加性效應均表現為增效作用，來源于日本晴的等位基因。在增效QTL中，qRRL5、qRRL2-2和qRRL6-2的加性效應值較大，加性效應百分率分別為35.66%、23.37%和20.84%。

圖2 14個CSSL的置換片段在水稻12條染色體上的分布Fig.2 Distribution of substituted segments from 14 CSSLs on 12 rice chromosomes

表1 兩親本及14個CSSL的表現及QTL分析Table 1 Phenotypic response and QTL analysis of 14 CSSLs and two parents

2.3 水稻耐Fe2+脅迫的QTL代換作圖

對與受體親本9311在相對根長上存在顯著差異的14個CSSL進行重疊置換片段分析，檢測到的9個QTL中有4個QTL只在含1個重疊片段的CSSL中被檢測到，圖3顯示了其置換片段的物理位置和長度。qRRL2-1被定位在第2染色體RM3340至RM233A之間、物理距離為1.35 Mb的置換片段上，qRRL5被定位在第5染色體RM1024至RM405之間0.95 Mb的物理距離內，qRRL6-1被定位在第6染色體頂端RM469處、物理距離為1.15 Mb的置換片段上，qRRL12被定位在第12染色體RM3331至RM12之間約1.75 Mb的物理距離內(圖3)。

圖3 Fe2+脅迫下來自1個置換片段的4個相對根長QTL的定位Fig.3 Mapping of four QTLs for relative root length identified from one substituted segment under Fe2+stress

其他5個QTL均在含2～3個重疊置換片段的CSSL中被檢測到。通過代換作圖法，將qRRL2-2和qRRL2-3分別定位到第2染色體RM5390～RM3795和 RM262～RM3512、物理距離分別為5.80 Mb和4.80 Mb的置換片段上，將qRRL6-2和qRRL6-3分別定位于第6染色體RM527～RM3498和RM3138～RM494、物理距離分別為10.15 Mb和1.65 Mb的置換片段上，將qRRL7定位在第7染色體RM1253～S7－9.61之間1.30 Mb的物理距離內(圖4)。

圖4 Fe2+脅迫下來自2～3個重疊置換片段的5個相對根長QTL的代換作圖Fig.4 Mapping of five QTLs for relative root length identified from 2 －3 substituted segments under Fe2+stress

綜上，圖5顯示了9個耐Fe2+脅迫相關QTL在水稻高密度物理圖譜上的分布及物理位置。

圖5 Fe2+脅迫下9個相對根長QTL在水稻染色體上的物理位置及長度Fig.5 Physical location and length of nine QTLs for relative root length on rice chromosomes under Fe2+stress

3 討論

根系是植物最活躍的養分吸收器官，也是對逆境脅迫信號因子最快作出響應的器官［17-19］。在鋁、鐵等重金屬離子脅迫下，植物表現的最初癥狀是根尖瓦解，抑制根系伸長，進而抑制地上部生長，且在受害程度上根部比地上部更為顯著［20-22］。大量研究結果也表明，在QTL定位研究中，群體中目標性狀的表型變異越大，則遺傳率越高，QTL定位的準確性越高［23］。因此，本研究選用相對根長性狀來衡量群體耐Fe2+脅迫的能力。該性狀既可在短期內體現各株系在Fe2+脅迫下的表型變異程度，又可消除CSSL群體內株系間的自身生長差異，且能簡便測定和準確定量，是用來評價水稻苗期階段耐Fe2+脅迫的有效指標［24］。

本研究共檢測到Fe2+脅迫下的9個相對根長QTL，除qRRL12的加性效應值為負，所在CSSL表現出對Fe2+脅迫敏感外，其余QTL的加性效應值均為正，所在CSSL均表現出比9311更強的耐Fe2+脅迫能力。與已發表的定位結果進行比較，發現位于水稻第2染色體上的相對根長QTL qRRL2-2與Fe2+脅迫下控制Fe2+吸收量的標記［2］和控制根干重的qRDW2［10］具有相近的染色體位置，而 qRRL2-3與Wan等［7］報道的Fe2+脅迫下的葉斑指數QTL位置一致;qRRL6-3與Wan等［7］報道的Fe2+脅迫下控制主根長的QTL位置一致;qRRL7與Fe2+脅迫下控制抗壞血酸還原酶活性的標記［2］和控制相對地上部干重的qRSW2［10］具有相近的位置。本研究中的qRRL12與 Wan 等［7］利用龍雜 8503/IR64 的 F2/F3群體定位的控制Fe2+脅迫下的株高QTL具有相同的染色體區間，效應卻相反。究其原因可能是雙親遺傳材料或者群體類型不同，也可能是使用了不同的耐性評價指標或不同的遺傳分析方法而導致的遺傳差異［25］。qRRL2-1、qRRL5、qRRL6-1 和 qRRL6-2 為 4個新發現的QTL，尚未見相關報道，它們均來源于耐Fe2+脅迫親本日本晴的等位基因，使所在CSSL的耐Fe2+脅迫能力加強。

qRRL2-2、qRRL5和qRRL6-2為本研究中3個效應值較大的QTL，加性效應百分率均在20%以上。可以考慮將與其緊密連鎖的分子標記，通過遺傳重組，應用于分子標記輔助育種或基因聚合育種中，以期培育出高效耐Fe2+脅迫的水稻新品種。本研究的QTL定位結果將有助于耐Fe2+脅迫等位基因的標記輔助選擇，在水稻育種中發揮作用。

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