小麥赤霉病菌拮抗菌AF0907的分離鑒定及其拮抗特性

徐劍宏， 王建偉， 胡曉丹， 祭 芳， 史建榮

(江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所，江蘇省食品質量安全重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，農業部農產品質量安全控制技術與標準重點實驗室，江蘇省轉基因安全評價公共服務中心，江蘇 南京 210014)

赤霉病是小麥、玉米等多種禾谷類作物的一種重要病害，廣泛分布于世界溫暖潮濕地區［1-7］，在長江中下游和江淮麥區的發生更為嚴重。尤其是近年來，由于小麥機械收割程度不斷提高，秸稈大量還田，麥糠吹散在田間，使小麥赤霉病發生逐漸加重［8-9］。在赤霉病的防治過程中大多使用化學藥劑，但是化學藥劑會對人類的身體健康和環境造成嚴重的危害。生物防治在植物病害的防治過程中發揮了很大的作用［10-11］，利用拮抗菌來控制赤霉病具有很好的防治效果［12-13］。芽孢桿菌生防菌不僅具有很強的環境適應性，而且是一種既能抑制植物病原菌生長和繁殖，又對人畜無毒，環境無害，所以具有很好的應用前景［14-15］。在生防菌的使用中，生防菌本身在環境中的適應性也是決定生防效果的關鍵因素。針對長江流域赤霉病發生嚴重的狀況，本研究從小麥根際土壤中分離到1株對小麥赤霉病菌有高效拮抗作用的芽孢桿菌AF0907，通過對該拮抗菌的分離鑒定、拮抗譜、拮抗特性及其對小麥赤霉病的田間防治效果的研究，以期為該拮抗菌在小麥赤霉病病害防治中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

病原真菌:小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麥紋枯病(Rizoctonia cerealis)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporium)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum cingulata)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、水稻惡苗病菌(Gibberella fujikuroi)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)、甜菜褐斑病菌(Cercospora beticola)、花生黑斑病菌(Ceroxpora arachidicola)、煙草灰霉病菌(Alternaria alternata)均為江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所分子技術與生物安全研究室分離并保存。

培養基:LB培養基成分為蛋白胨10.0 g/L、酵母膏 5.0 g/L、NaCl 2.0 g/L(pH 7.0 ～7.5)和瓊脂15.0～20.0 g/L，用于拮抗菌的分離培養;PDA培養基成分為馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L和瓊脂15.0～20.0 g/L，用于拮抗菌的對峙培養篩選。

1.2 土樣樣品采集及拮抗菌的分離和篩選

于江蘇省農業科學院小麥試驗地采集小麥根際土壤，采用序列稀釋法制備不同濃度的土壤稀釋液，分別為1 ×10－7、1 ×10－8、1 ×10－9，取不同稀釋度的土壤懸液100 μl涂于LB培養基上，置于30℃培養48 h后，挑取形態、顏色等不同的細菌單菌落經純化后，采用平板對峙法測定不同菌株對禾谷鐮刀菌的抑菌活性［16］:在PDA平板距中心25 mm處的4個對稱點接待測細菌，培養1 d后，分別在平板中央接種小麥赤霉病菌菌塊(菌塊直徑為6 mm)，每個處理重復3次，在28℃培養5 d后觀察有無抑菌帶的形成(若有抑菌帶的形成，則該測試菌株為拮抗菌)。

1.3 AF0907菌株的鑒定

菌株的生理生化鑒定參照文獻［17］。菌株的16S rDNA全序列克隆和序列測定與比較參照文獻［18］:采用 CTAB 法提取 AF0907 基因組 DNA［18］，并以提取的DNA作為PCR反應模板，利用16S rDNA通用引物:正向引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物 5-TACCTTGTTACGACTT-3'，進行 PCR擴增，瓊脂糖電泳驗證PCR產物后送上海生工生物工程公司測序。根據16S rDNA測序結果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov 在線查詢分析，利用 Blast軟件在GenBank中與其他16S rDNA序列進行同源性比較，選擇同源性相近的序列用MEGA version 5軟件構建AF0907系統進化樹。

1.4 拮抗菌AF0907的拮抗特性研究

1.4.1 拮抗譜的測定 選取抑菌能力較強的拮抗菌AF0907，采用對峙培養法對各種不同的植物病原真菌(小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、棉花枯萎病菌、葡萄炭疽病菌、油菜菌核病菌、水稻稻瘟病菌、水稻惡苗病菌、煙草赤星病菌、甜菜褐斑病菌、花生黑斑病菌、煙草灰霉病菌)進行抑菌活性測定，即在PDA平板距中心25 mm處的4個對稱點接AF0907，培養1 d后，分別在平板中央接種各病原真菌菌塊(菌塊直徑為6 mm)，每個處理重復3次，上述處理在28℃培養5 d測定抑菌圈的直徑。

1.4.2 拮抗菌對小麥赤霉病菌菌絲的影響 在100 ml PD培養基中接入小麥赤霉菌的菌絲后，加入在PD培養基中培養后處于對數生長期(OD值為1.5)的 AF0907 培養液10 ml，28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養5 d后，觀察培養液的顏色變化，抽濾，烘干菌絲，測其質量，每個處理設4個重復，以加入PD培養基作為對照;同時用顯微鏡觀察加入拮抗菌后赤霉菌菌絲的形態，以未加拮抗菌對峙培養的小麥赤霉病菌菌絲作為對照。

1.4.3 拮抗菌對小麥赤霉病菌孢子萌發的影響

參照文獻［19］，略有改動，利用6%綠豆湯孢子培養液于25℃光照培養禾谷鐮刀菌5 d后，用PD培養液調節至1 ml懸浮液中含有1.0×105個孢子;將AF0907發酵液用PD培養液分別稀釋10倍、50倍、100倍，然后將孢子懸浮液和不同稀釋度的發酵液按照1∶1混合，25℃培養12 h后觀察赤霉孢子的萌發率，以孢子懸浮液和PD培養液的混合液作為對照，每個處理4個重復。

1.5 拮抗菌AF0907對田間小麥赤霉病的防治效果

田間試驗于2010年在江蘇省農業科學院六合基地小麥試驗田進行，小麥品種為揚麥158，設6個處理，分別為:噴施赤霉孢子液處理(對照1)、先噴施拮抗菌液再噴赤霉孢子液處理、先噴赤霉孢子液再噴拮抗菌液處理、同時噴施拮抗菌液和赤霉孢子液處理、噴施清水處理(對照2)和噴施拮抗菌液處理，每個處理重復5次，每次50株。在小麥揚花期之前，進行該試驗，20 d后，調查小麥赤霉病發病的病小穗率和病情指數。病小穗率=病小穗數/總小穗數×100%;病情指數=∑100(Hi×i)/(H×4)(Hi:各級嚴重度對應的病穗數;i:病情嚴重級數;H:調查總穗數;小麥赤霉病分級標準，0級:無病;1級:發病部分占整個麥穗的1/4以下;2級:發病部分占整個麥穗的1/4～1/2;3級:發病部分占整個麥穗的1/2～3/4;4級:發病部分占整個麥穗的3/4以上)。

2 結果

2.1 拮抗菌的分離與篩選

從小麥根系土壤分離到4株小麥赤霉病菌的拮抗細菌，采用平板對峙法測定其對小麥赤霉病菌的抑菌帶的寬度(菌邊緣到赤霉菌邊緣的垂直距離)，結果表明，拮抗細菌AF0907的拮抗效果最為明顯(表1)，因此選擇AF0907進行深入研究。

表1 赤霉病菌拮抗菌的拮抗活力Table 1 Antagonistic activity of strains against F.graminearum

2.2 赤霉病菌拮抗菌株AF0907的鑒定

菌株AF0907在LB平板上菌落呈乳白色，直徑2 mm左右，形狀橢圓，中央凹陷，表面干燥，有褶皺，不透明(圖1);生理生化特征結果(表2)顯示AF0907為革蘭氏陽性，有芽孢、無伴孢晶體的細菌表2示。把AF0907的16SrDNA基因序列在NCBI上使用Blast比對，從 GenBank數據庫中獲得與 AF0907的16SrDNA序列相近的標準序列數據，采用MEGA中的鄰位相連法(Neighbor-joining)構建菌株16SrDNA基因序列的系統發育進化樹。由圖2可知，AF0907與 Bacillus subtilis DSM 10(NR027552)、Bacillus subtilis SBRh5(HQ443229.1)等菌株位于同一個分支上，同源性達到99%以上，結合遺傳距離、形態特征以及生理生化特征，可以把AF0907鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。把菌株AF0907的16SrDNA基因序列遞交GenBank數據庫，得到序列的登錄號為GU272021。

圖2 基于16SrDNA的菌株AF0907的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequence of strain AF0907

表2 AF0907菌株的生理生化特征Table 2 Physio-biochemical characteristics of strain AF0907

圖1 AF0907在LB上的菌落形態Fig.1 The colony morphology of strain AF0907 on LB plate

2.3 拮抗菌AF0907的拮抗特性

2.3.1 拮抗譜 采用對峙培養法測定 Bacillus subtilis AF0907對11種病原菌的拮抗活性，結果顯示菌株AF0907具有廣譜抗植物病原真菌的特性，除了對小麥赤霉病菌具有很強的拮抗能力外，對其他病原菌，如小麥紋枯病菌、煙草赤星病菌、甜菜褐斑病菌、棉花枯萎病菌等抑菌活性都較強(表3)。

表3 AF0907菌株對不同病原菌的抗菌活性Table 3 Antagonistic activities of strain AF0907 against different plant pathogens

2.3.2 拮抗菌AF0907對小麥赤霉病菌菌絲的影響

在PD培養基中接入小麥赤霉病菌菌絲后，加入拮抗菌AF0907。結果(表4)顯示，與對照相比，AF0907對赤霉病菌的菌絲生長影響顯著，由對照的0.69 g下降為0.15 g，抑制率達78.26%。用顯微鏡觀察不同處理的赤霉菌的菌絲，和對照相比，加入拮抗菌處理的赤霉病菌菌絲邊緣形態異常，不能自由伸展，排列成柵欄狀，一些基質菌絲膨大變粗，并且分支增多。

表4 菌株AF0907對小麥赤霉病菌菌絲的影響Table 4 Effect of strain AF0907 on hyphal growth of F.graminearum

2.3.3 拮抗菌AF0907對小麥赤霉菌孢子萌發的影響 用不同稀釋度的拮抗菌發酵液處理禾谷鐮刀菌的孢子液后，孢子的萌發率受到了嚴重影響，當拮抗菌液10倍稀釋時，對孢子萌發的抑制率達到93.04%，隨著稀釋度的增加，抑制率有所下降，當拮抗菌液100倍稀釋時，抑制率為85.39%(表5)。

表5 AF0907菌液對小麥赤霉菌菌孢子萌發的影響Table 5 Effect of strain AF0907 on the spore germination of F.graminearum

2.4 拮抗菌AF0907對小麥赤霉病的田間防治效果

把拮抗菌AF0907在揚花期噴施到揚麥158上，調查小麥赤霉病的發生情況，由表6可以看出，與噴施清水處理(對照2)相比，直接噴施拮抗菌AF0907的小麥病小穗率由29.24%下降為4.45%，病情指數由24.44%下降為16.67%，防治效果達到31.79%。先噴施拮抗菌液再噴施赤霉孢子液處理可以有效地減輕赤霉病的發病率，對赤霉病的防治效果達到40.37%，而先噴施赤霉孢子液再噴施拮抗菌液處理下的防治效果為29.26%。

表6 菌株AF0907對小麥赤霉病的田間防治效果Table 6 The field control efficiency of strain AF0907 against F.graminearum

3 討論

小麥赤霉病的危害近年來日趨嚴重，尤其是2010年和2012年大面積爆發的小麥赤霉病害對中國的糧食安全造成了很大的危害。對于赤霉病的防治，由于長期使用多菌靈等化學類農藥，在中國很多地方出現了抗藥性問題［20-21］，因此急需一種能控制赤霉病害的替代方法。利用拮抗菌來控制植物病原菌的生長和繁殖具有很好的使用前景，已經有一些成功使用的先例［12，22］。芽孢桿菌由于抗逆性強，容易在環境中定殖，對人畜無害，不污染環境等優點，所以是一種很好的生防菌。本研究從小麥的根系土壤分離到1株對赤霉病菌具有高效抑制作用的拮抗菌AF0907，經過菌株的生理生化特性和系統進化分析被鑒定為枯草芽孢桿菌。該拮抗菌不但對小麥赤霉病菌具有很好的拮抗能力，而且對其他10種常見的植物病原菌都具有很好的拮抗活性。AF0907和小麥赤霉病菌一起培養時，可以抑制小麥赤霉病菌菌絲的生長，使菌絲邊緣形態異常，不能自由伸展，一些基質菌絲膨大變粗，并且分支增多，同時AF0907還可以抑制小麥赤霉病菌孢子的萌發，因此在拮抗菌AF0907的作用下，小麥赤霉病菌不能正常生長和繁殖。在田間試驗中，噴施拮抗菌AF0907可以降低小麥赤霉病的發病程度，防治效果可以達到15.74%以上，尤其在先噴施拮抗菌，讓其在小麥中定殖后，再噴施赤霉孢子液，可以使防治效果提高到40.37%，因此拮抗菌AF0907在小麥赤霉病的防治中，甚至在其他植物真菌病害的防治中將會有廣泛的應用前景。對于生防菌的研究，國內外也有不少研究，主要研究拮抗菌的分離鑒定及拮抗特性及拮抗物質的純化鑒定。枯草芽孢桿菌能產生多種抑制植物病原真菌的拮抗物質，主要為低分子量的多肽類抗生素和一些高分子量的蛋白質類拮抗物質［23］。在研究中已經初步發現拮抗菌AF0907產生的拮抗物質主要在上清液中，且都能夠耐受一定的pH、溫度等因素的影響，對于具體拮抗物質的特性和結構還有待進一步研究。

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