ApoG2聯合紫杉醇對鼻咽癌細胞及其移植瘤的抑制作用觀察

鐘 梅，汪森明，石豐榕，朱震威

(南方醫科大學附屬珠江醫院，廣州510282)

鼻咽癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發病率呈逐年上升趨勢［1］，盡管近年來其治療有較大進展，但腫瘤轉移或治療后復發率仍較高。Apogossypolo ne(ApoG2)是棉酚的一種新型衍生物，具有抗腫瘤活性高、毒性小、穩定性好的特點［2］。紫杉醇(PTX)從紫杉樹皮中提取，是作用于細胞微管的主要抗腫瘤藥物之一，對多種腫瘤有明顯療效。近期我們觀察了ApoG2聯合PTX對人鼻咽癌CNE-2細胞及其移植瘤的抑制作用，并初步探討其可能機制，旨在為鼻咽癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 Balb/c-nu裸鼠由廣東省實驗動物中心提供，4～6周齡，體質量16～20 g，雌雄不拘，在無特定病原體(SPF)條件下飼養。動物質量和環境設施合格證號分別為:SCXK(粵)2008-0002、SYXK(粵)-2007-0081。人鼻咽癌CNE-2細胞株由南方醫科大學腫瘤研究所細胞中心提供(采用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養)。ApoG2由美國密歇根大學醫學院腫瘤中心徐梁教授惠贈。PTX購自海南中化聯合制藥有限公司。兔源Bcl-2多克隆抗體為美國CST公司產品，兔SP檢測試劑盒(SP-9000)、DAB顯色試劑盒(ZLI-9031)、AP標記山羊抗兔IgG均購自北京中杉公司。其余試劑為國產分析純。

1.2 ApoG2、PTX對CNE-2細胞生長的抑制作用觀察

1.2.1 ApoG2、PTX 干預及半數抑制濃度(IC50)、細胞抑制率測定 取對數生長期CNE-2細胞，計數為8×104個/mL，取每孔100 μL接種于96孔培養板，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，待24 h細胞貼壁后加入含不同藥物的培養液干預。①ApoG2干預:加入含ApoG2完全培養液200 μL，ApoG2濃度分別為為 5、10、20、40、60 μmol/L;②PTX 干預:加入含PTX 的完全培養液 200 μL，濃度分別為 0.001、0.01、0.1、1、2 μmol/L;③ApoG2 及 PTX 聯合干預:加入含ApoG2及PTX的完全培養液200 μL，兩藥濃度不變。對照孔不加細胞懸液只加含0.1%DMSO培養液200 μL。加藥后每個濃度設3個復孔，繼續放入培養箱中培養。48 h后終止培養，每孔加入MTT20 μL(5 mg/mL)培養4 h，離心吸去培養液，每孔加入150 μL DMSO震蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶聯免疫檢測儀檢測490 nm波長處吸光度值(OD值)。計算48 h的IC50、細胞抑制率及兩藥相互作用系數(CDI)。

1.2.2 ApoG2、PTX干預及細胞凋亡率檢測 取對數生長期CNE-2細胞消化傳代，待細胞長至70%滿度時，吸棄舊培養液分為四組。對照組不干預;ApoG2 組予 ApoG2 20 μmol/L，PTX 組予 PTX 0.01 μmol/L，聯合組予 ApoG2及 PTX，藥物濃度同

1.2.1 。干預后繼續培養48 h，取5 ×105個細胞，常規低速離心5 min，棄上清液加入400 μL的Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL的 Annexin V-FITC混勻，加入5 μL碘化丙啶(PI)混勻，室溫條件下避光反應10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3 ApoG2、PTX對CNE-2細胞皮下移植瘤的抑瘤作用觀察

1.3.1 皮下移植瘤模型建立及ApoG2、PTX干預取于H-DMEM培養基中培養的對數生長期CNE-2細胞制備細胞懸液。于12只Balb/c-nu裸鼠右背部皮下各接種5×105個CNE-2細胞(約0.1 mL)。待肉眼可見局部腫瘤生長時將小鼠隨機分為四組(各3只)腹腔給藥:對照組注射生理鹽水;PTX組注射PTX 20 mg/kg(0.2 mL)，隔日 1 次，共3 次;ApoG2組注射ApoG2 80 mg/kg(0.2mL)，共5次;聯合組聯合應用ApoG2及PTX，給藥劑量、方式及時間同單藥組。

1.3.2 觀察項目 ①腫瘤抑制率:待對照組腫瘤體積超過1 cm3(給藥15 d左右)時處理小鼠，完整剝離皮下瘤結節，稱重，計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=(對照組瘤重－實驗組瘤重)/對照組瘤重。繪制移植瘤生長曲線。②腫瘤組織Bcl-2蛋白表達:取各組移植瘤標本，石蠟包埋，4 μm切片。常規二甲苯脫臘，梯度酒精水化后置于枸櫞酸緩沖液中微波加熱至92～98℃，2 min后改為小火10 min以修復抗原，自然冷卻至室溫，按SP試劑盒說明書完成免疫染色各步驟，以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定:每組選取3張切片進行分析。Bcl-2陽性表達為腫瘤細胞胞質染成棕黃色。高倍鏡(400×)下觀察10個高倍視野，計數1 000個細胞，計算陽性細胞百分率。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件行統計學處理。數據以ˉx±s表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，多個樣本均數比較應用單因素方差分析(Oneway ANOVA)。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞生長抑制情況

2.1.1 細胞抑制率 ApoG2、PTX單用及聯用48 h細胞抑制率見表1。由表1可見，ApoG2、PTX單用對細胞生長均有抑制作用，與對照組比較，FApoG2=601.523，PApoG2=0.000;FPTX=482.730，PPTX=0.000;聯合組抑制率隨兩藥濃度增強逐漸增加，兩者之間存在交互效應(F=12.590，P=0.000)，CDI＜1，兩者發揮協同效應。作用48 h后ApoG2與PTX的IC50值分別為 45.41 μmol/L 和 0.13 μmol/L。

表1 ApoG2、PTX單用及聯用48 h CNE-2細胞抑制率(n=3，%，ˉx±s)

2.1.2 細胞凋亡率 20 μmol/L APoG2、0.01 μmol/L PTX及二者聯用48 h細胞凋亡率分別為:對照組(2.17 ±0.32)%，APoG2 組(4.39 ±0.30)%，PTX 組(18.81 ±1.32)%，聯合組(24.13±1.56)%。聯合組明顯高于單藥組，P＜0.05。提示ApoG2與PTX聯用較各單藥應用能更明顯誘導CNE-2細胞凋亡。

2.2 移植瘤生長抑制情況 皮下接種鼻咽癌CNE-2細胞4 d后肉眼可見局部腫瘤生長。

2.2.1 移植瘤生長情況 各組移植瘤生長曲線見圖1。對照組、PTX組、ApoG2組、聯合組治療初期腫瘤均逐漸增大.但對照組生長速度在各時間點上均快于3個治療組。從第5天開始各治療組和對照組相比，腫瘤體積的變化差異有顯著性(P＜0.01)。

圖1 各組移植瘤生長情況

2.2.2 瘤重及抑瘤率 治療結束后各組平均瘤重及抑瘤率比較見表2。

表2 治療結束四組平均瘤重及抑瘤率比較(n=3，ˉx±s)

2.2.3 腫瘤組織Bcl-2蛋白表達 Bcl-2表達率對照組為(91.29±3.61)%，ApoG2組為(67.12 ±4.57)%，PTX 組為(50.62 ±2.80)%，聯合組為(31.54±6.02)%;與對照組比較，PTX 組、ApoG2組和聯合組表達率均明顯降低，P＜0.01;聯合組顯著低于PTX組和ApoG2組，P均＜0.01。

3 討論

研究證實，ApoG2是Bcl-2的小分子阻斷劑，能夠誘導多種細胞凋亡［3，4］。PTX是目前已經明確的作用于細胞微管的抗腫瘤藥物［5］，其通過促進微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白穩定，抑制細胞有絲分裂，而對正常的細胞基本無影響，是目前治療鼻咽癌的重要化療藥物之一［6］。近年研究發現，微管的完整性被破壞后可導致Bcl蛋白磷酸化，促使細胞發生凋亡;Bcl-2磷酸化可抑制Bcl-2與Bax二聚體的形成，抑制Bcl-2的功能［7］。

線粒體依賴性細胞凋亡通路是指調節線粒體膜表面Bcl-2家族蛋白的表達，引起細胞色素C(Cytc)從線粒體內膜釋放.促進凋亡體(由Cyt-c、Apaf和Caspase-9)的形成，進一步活化效應性的Caspase，從而調控細胞凋亡。高表達的抗凋亡的Bcl-XL和Bcl-2蛋白可以與線粒體外膜VDAC(電壓依賴經的離子通道)結合，保護線粒體膜的完整性，當ApoG2結合抗凋亡蛋白并抑制其保護功能后，線粒體膜的完整性很快就被破壞;Bcl-2和Bcl-XL蛋白過表達均會抑制線粒體依賴性細胞凋亡通路，且會增加細胞對放化療的抵抗性。Arnold等［8］研究表明，ApoG2能抑制淋巴瘤細胞增殖，誘導細胞色素C從線粒體釋放到細胞質，促進凋亡相關蛋白Caspase-3和Caspase-9活化，最終誘導淋巴瘤細胞發生凋亡。

Bcl-2是迄今為止功能最明確的細胞凋亡拮抗基因，其廣泛分布于細胞膜系統(特別是在線粒體膜上)，有阻止細胞色素C釋放、抑制細胞凋亡的作用。抗凋亡的Bcl-2家族蛋白在抑制腫瘤細胞凋亡中起著關鍵作用，這類蛋白在許多類型的腫瘤中均呈高表達，如鼻咽癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌和肺癌［9，10］。鑒于其可能與腫瘤的放療抵抗、化療耐藥以及不良預后相關，抑制Bcl-2活性或降低Bcl-2的表達水平可能成為鼻咽癌治療的一條新途徑。

本研究結果顯示，ApoG2與PTX單藥對細胞的抑制作用隨藥物濃度提高而增強，呈濃度依賴性，二者聯合應用有協同作用;PTX與ApoG2聯用的凋亡率高于單藥應用，但總體凋亡率并不高，原因可能是部分凋亡晚期細胞已碎裂成碎片，與壞死無法區別;細胞凋亡早期細胞內結構已發生變化，但細胞膜完整，染料無法進入細胞內以及結合外翻的細胞膜進行染色。本研究結果顯示，ApoG2、PTX及兩者聯用均可抑制移植瘤生長，隨著作用時間的延長抑制作用更加明顯，此與前期研究及國外文獻報道相符［11，12］;從第 5 天起至治療結束，聯合組腫瘤生長抑制率均明顯高于ApoG2組及PTX組，顯示ApoG2及PTX有明顯的協同作用，ApoG2可增強PTX的敏感性。為進一步探討這種聯合效應是否可特異性抑制靶蛋白的表達，我們采用免疫組化法檢測了移植瘤組織Bcl-2蛋白的表達情況，結果提示PTX與ApoG2聯用可協同抑制Bcl-2蛋白表達。

綜上所述，ApoG2具有抗鼻咽癌及化療增敏作用，且無明顯毒副反應，可能是一種良好的治療鼻咽癌的新藥。

［1］Jia WH，Huang QH，Liao JY，et al.Trends in incidence and mortality of nasopharyngeal carcinoma over a 20-25 year period(1978/1983-2002)in Sihui and Cangwu counties in southern China［J］.BMC Cancer，2006，6(期?):178.

［2］Kitada S，Leone M，Sareth S，et al.Discovery，characterization，and structure-activity relationships studies of proapoptotic polyphenols targeting B-cell lymphocyte/leukemia-2 proteins［J］.J Med Chem，2003，46(20):4259-4264.

［3］Lin J，Wu YJ，Yang DJ，et al.Effect of apogossypolone on induction apoptosis in multiple myeloma cells and its mechanisms［J］.J Exp Hematol，2009，17(1):92-98.

［4］Hu ZY，Zhu XF，Zhong ZD，et al.ApoG2，a novel inhibitor of antiapoptotic Bcl-2 family proteins，induces apoptosis and suppresses tumor growth in nasopharyngeal carcinoma xenografts［J］.Int J Cancer，2008，123(10):2418-2429.

［5］Eum KH，Lee M.Crosstalk between autophagy and apoptosis in the regulation of paclitaxel-induced cell death in v-Ha-ras-transformed fibroblasts［J］.Mol Cell Biochem，2011，348(1-2):61-68.

［6］Vermorken JB，Remenar E，van Herpen C.Cisplatin，fluorouracil，and docetaxel in unresectable head and neck cancer［J］.N Engl J Med，2007，357(17):1695-1704.

［7］Vantieghem A，Xu Y，Assefa Z，et al.Phosphorylation of Bcl-2 in G2/M phase-arrested cells following photodynamic therapy with hypericin involves a CDKl-mediated signal and delays the onset of apoptosis［J］.J Biol Chem，2002，277(40):37718-37731.

［8］Arnold AA，Aboukameel A，Chen J，et al.Preclinical studies of Apogossypolone:a new nonpeptidic pan small-molecule inhibitor of Bcl-2，Bcl-XL and Mcl-1 proteins in follicular small cleaved cell lymphoma model［J］.Mol Cancer，2008，7(20):453-463.

［9］Evans JD，Cornford PA，Dodson A，et al.Detailed tissue expression of bcl-2，bax，bak and bcl-x in the normal human pancreas and in chronic pancreatitis，ampullary and pancreatic ductal adenocarcinomas［J］.Pancreatology，2001，1(3):254-262.

［10］Yan yan，Qiao Minze，Jia Xiumei，et al.FENG.Expressions of JAK1，p-STAT3 and bc-l 2 in Gastric Cancer and Their Significance［J］.Cancer Res Prev Treat，2009，36(8):657-661.

［11］Niu XG，Wang SM，Ding WM.Inhibition and apoptosis effects of apogossypolone on breast cancer cell line MCF-7［J］.Tumor，2010(12):1022-1026.

［12］Banerjee S，Choi M，Aboukameel A，et al.Preclinical studies of apogossypolone，a novel pan inhibitor of bcl-2 and mcl-1，synergistically potentiats cytotoxic effect of gemcitabine in pancreatic cancer cells［J］.Pancreas，2010，39(3):323-331.