鯉魚湯對阿霉素腎病大鼠腎臟MMP-2和TIMP-2表達的影響

高 英，齊玉梅，沈 衛，郭云良，劉宗寶，張 宇，肖慧娟

(1天津醫科大學公衛學院營養與食品衛生系，天津300070;2天津市第三中心醫院;3青島大學醫學院中西醫結合中心;4青島大學醫學院松山醫院)

阿霉素腎病模型是出現腎病綜合征表現并伴有小管間質纖維化和腎小球硬化傾向的一個典型的實驗模型［1］。研究表明，非腫瘤性腎臟疾病的病理改變實質均是細胞外基質(ECM)在腎小球和腎間質中異常堆積的結果［2］。ECM的主要成分Ⅳ型膠原構成了腎小球基底膜(GBM)的基本網架結構，也是腎小管基底膜(TBM)中最豐富的成分，主要受ECM的降解酶系基質金屬蛋白酶(MMPs)調節，其中MMP-2是降解Ⅳ型膠原最重要的酶之一，而基質金屬蛋白酶抑制劑-2(TIMP-2)是MMP-2內源性抑制因子。中醫古籍及近年臨床報道認為，鯉魚湯有利尿消腫的作用［3～5］。2011年8～11月，我們觀察了鯉魚湯對阿霉素腎病大鼠腎組織MMP-2和TIMP-2表達的影響，探討鯉魚湯利水消腫、改善蛋白尿、緩解腎臟纖維化的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 動物:Wistar大鼠40只，8周齡，體質量(200±20)g，SPF級，購自山東醫藥有限公司(許可證號:SLXK魯20080002)。藥物及試劑:鯉魚湯(鯉魚為購自山東萊西產芝水庫8周齡野生鯉魚，按照魚水比重1∶4，先文火煎煮至開鍋，后武火煎煮60 min，濾除魚湯;按此法再煎煮第二遍，將兩遍魚湯混合，濃縮至300%。1 mL含鯉魚3 g)用聚乙烯塑料袋分袋密封包裝，置于－20℃冰箱中備用。厄貝沙坦片(批號:1A101，賽諾菲安萬特制藥)。阿霉素(ADR，批號:110402，浙江海正藥業生產)。兔抗MMP-2親和純化抗體(批號:bs-0412R)、兔抗TIMP-2親和純化抗體(批號:bs-0416R)購自北京博奧森生物技術有限公司。超敏即用型二步法檢測試劑盒(PV-9001)購自北京中衫金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阿霉素腎病模型制備及分組 大鼠適應性喂養1周。尿蛋白檢測陰性后隨機取10只作為對照組，其余30只參照 Bertani［6］方法單劑量尾靜脈注射阿霉素6.2 mg/kg制作阿霉素腎病模型，制模后隨機分為模型組、厄貝沙坦組、鯉魚湯組，每組各10只。

1.2.2 干預方法 造模后1周對大鼠行灌胃干預。灌胃藥物:鯉魚湯組為300%鯉魚湯9 mL/kg(按照大鼠與人體表面積的折算系數0.018計算，相當于70 kg正常成人劑量);厄貝沙坦組為厄貝沙坦50 mg/kg(溶解于9 mL/kg的飲用水中);模型組及對照組為9 mL/kg飲用水;均1次/d，共干預8周。

1.2.3 觀察項目 ①腎功能指標:收集各組造模前及造模后第1～8周晨尿及12 h尿液，記錄尿量并檢測尿蛋白濃度。干預后8周各組腹腔注射水合氯醛4 mL/kg全身麻醉，經心臟取血＞5 mL，檢測血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr);②腎組織病理變化:干預8周后處死大鼠，取腎臟標本置于4%多聚甲醛中固定;常規脫水、透明、浸蠟、包埋，連續冠狀位切片(厚度4 μm)，HE染色后光鏡下觀察腎組織形態學特點，IPP 6.0自動圖像分析系統下測定腎小球平均截面積(AG)，計算腎小球體積(Vc)。Vc=β/k(AG)3/2(式中β=1.38，k=1.10)，百分比評分法計算腎小管損害率，計算10個高倍鏡視野(×400)腎皮質中發生病變(包括腎小管萎縮、膨漲、擴張、管型、炎癥細胞浸潤，纖維化)的腎小管數目占腎小管總數的百分比;③腎皮質MMP-2、TIMP-2表達:干預后第8周采用免疫組化SABC法測定。腎組織石蠟包埋、切片，加抗原修復液(EDTA-T修復液，pH=8.0)行抗原修復，室溫冷卻30～50 min，PBS沖洗3 min×2次、室溫孵育10 min，滴加一抗(MPP-2濃度1∶100;TIMP-2濃度1∶200)，再經溫室孵育、PBS沖洗;滴加二抗，37℃孵育后PBS沖洗2 min×3次，應用DAB溶液顯色10 min;自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、中性樹膠加蓋封片。每張切片隨機選4個高倍鏡下腎皮質視野(×400)，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定平均光密度值(OD值)，每個視野計算10個MOD值的均值作為該片的OD值，代表陽性部位的蛋白表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件。計量資料用ˉx±s表示。尿蛋白與時間交互作用采用重復測量方差分析，多組樣本資料兩兩比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett'T3法檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎功能指標 造模1周對照組尿蛋白明顯低于其余三組(P＜0.05)，說明造模成功。造模5周、9周厄貝沙坦組、鯉魚湯組12 h尿蛋白均低于模型組(P＜0.05);時間因素與處理因素之間存在交互作用，模型組12 h尿蛋白量呈時間依賴性上升，而鯉魚湯組、厄貝沙坦組12 h尿蛋白含量隨時間降低，明顯低于模型組(P均＜0.05)，鯉魚湯組、厄貝沙坦組之間差異無統計學意義。見表1。各組TP、ALB、Cr及BUN水平比較見表2。

表1 各組造模前后12 h尿蛋白水平比較(mg/12 h，ˉx±s)

表2 各組干預后 TP、ALB、BUN、Cr 比較(ˉx±s)

2.2 腎組織病理變化 第9周末模型組腎組織光鏡下可見腎小管蛋白管型、炎性細胞浸潤、間質纖維化及腎小球硬化。模型組大鼠腎小球截面積、腎小球體積及腎小管損害率高于對照組組(P＜0.05)，并出現小管纖維化、膨脹、管型等腎小管損害。鯉魚湯組、厄貝沙坦組腎小球截面積、腎小球體積及腎小管損害率小于模型組(P＜0.05)。見圖1。

2.3 腎皮質 MMP-2、TIMP-2表達 MMP-2、TIMP-2表達主要定位于腎小管上皮細胞。與對照組比較，模型組 MMP-2、TIMP-2蛋白表達均降低，MMP-2/TIMP-2值降低(P＜0.05)。與模型組比較，鯉魚湯組、厄貝沙坦組MMP-2、TIMP-2表達上調，且MMP-2/TIMP-2升高(P＜0.05)，鯉魚湯組、厄貝沙坦組比較差異無統計學意義。見表3。

圖1 各組腎小球截面積、腎小球體積、腎小管損害率比較

表3 各組腎皮質MMP-2、TIMP-2表達及MMP-2/TIMP-2 比較(OD 值，ˉx ±s)

3 討論

腎間質纖維化、腎小球硬化是不同腎病終末期的共同形態學表現，均是以ECM代謝失衡、異常堆積為病理基礎［7，8］。ECM的主要成分為Ⅳ型膠原，Ⅳ型膠原合成與降解失衡或多肽鏈結構異常可使ECM過度蓄積，破壞GBM與TBM的正常結構，使其喪失原有的結構和功能，致蛋白尿產生，最終發展為纖維化乃至硬化。厄貝沙坦在治療腎病的臨床應用中發現具有更強阻斷，更強降壓作用，對降低微量及大量蛋白尿，抑制氧化應激，降低腎病終點事件發生率效果優于氯沙坦、纈沙坦等藥物。本研究以厄貝沙坦為藥物對照，觀察鯉魚湯腎臟保護作用的療效，發現第5周～第9周，鯉魚湯組、厄貝沙坦組尿蛋白排泄率呈時間依賴性降低，BUN、Cr、尿蛋白明顯低于模型組，TP、ALB升高，鯉魚湯組、厄貝沙坦組尿蛋白排泄率、BUN、Cr、TP、ALB 的差異無統計學意義，提示鯉魚湯亦具有利水消腫、減輕蛋白尿的作用，推測其機制可能為升高血漿膠體滲透壓，減少ECM的蓄積以維持GBM、TBM的完整性。

MMP-2是MMPs家族的重要成員，主要降解ECM成分中的Ⅳ型膠原。TIMP-2是其內源性抑制劑，它們共同調節ECM的新陳代謝。MMP/TIMP是ECM維持穩定性和完整性的決定性因素［9］。在腎病不同階段，MMP-2、TIMP-2的表達存在不同，腎病早期(出現纖維化前)MMP-2代償性表達上調，而腎病晚期出現硬化時MMP-2、TIMP-2表達均下調，ECM蓄積，導致腎小球系膜基質堆積出現間質纖維化［10，11］。本研究發現，模型組腎小球截面積、腎小球體積均較對照組增大，并出現纖維化及硬化，MMP-2、TIMP-2表達均降低，且 MMP-2/TIMP-2值降低，即MMP-2下調的程度超過TIMP-2的下調程度，TIMP-2相對高表達，提示模型組腎臟ECM合成增加;鯉魚湯組與厄貝沙坦組MMP-2、TIMP-2蛋白表達均有所上調，腎小球截面積、腎小球體積均較模型組減小，但二者之間差異無統計學意義，提示應用鯉魚湯后腎臟炎癥侵潤、纖維化病理變化有所改善。

綜上所述，鯉魚湯具有腎臟保護作用。其機制可能是鯉魚魚肉或魚鱗中含有某種活性成分，參與了ECM降解酶系的某個作用環節，有利于調節MMP-2/TIMP-2的平衡以及濾過膜重建，從而減少ECM的蓄積并促進其降解，緩解腎臟纖維化、硬化的進程。鯉魚作為一種價格低廉、天然易獲得的食材，具有較大的藥用價值。

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