雙調(diào)控雙功效溶瘤腺病毒的構(gòu)建及意義

孫立臣，潘旭波，周先亭，宋占文，蘇長(zhǎng)青

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院，山東煙臺(tái)264000;2第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院)

隨著腫瘤生物學(xué)及遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，基因治療已成為肝癌綜合治療中的重要部分。我們前期構(gòu)建了針對(duì)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的腫瘤特異性增殖型腺病毒CNHK500，該腺病毒由hTERT啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒早期增殖基因E1a表達(dá)，HIF-1調(diào)控序列區(qū)缺氧反應(yīng)元件(HRE)調(diào)控早期增殖基因E1b表達(dá)，使其在雙啟動(dòng)子的調(diào)控下實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌細(xì)胞的特異性殺傷和溶解作用，又稱溶瘤腺病毒［1，2］。2009年1月～2011年12月，我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上聯(lián)合Survivin基因小發(fā)卡RNA(shRNA)構(gòu)建了雙調(diào)控雙功效腫瘤特異性溶瘤腺病毒(CNHK500-shSRV-mE，以下簡(jiǎn)稱雙調(diào)控腺病毒)，旨在為肝癌的基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，正常成纖維細(xì)胞系MRC-5、BJ購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、BEL-7402來源于中科院上海細(xì)胞所，人胚胎腎293細(xì)胞株購(gòu)自加拿大Microbix Biosystems公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自GIBCO BRL公司。E1a擴(kuò)增引物(上游:5'-GTG TAT TTA TAC CCG GTG AG-3'，下游:5'-TGG AAG ATT ATC AGC CAG TAC-3')由上?；瞪锕就瓿?。

1.2 雙調(diào)控腺病毒構(gòu)建及鑒定

1.2.1 構(gòu)建 前期構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒 pSG500，其E1a基因上游插入了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子(hTERT)，E1b上游插入了缺氧調(diào)控元件序列(HRE)，于E1a表達(dá)盒上游預(yù)留了BglⅡ酶切位點(diǎn)。根據(jù)GenBank NM001168的Survivin基因序列設(shè)計(jì)特異shRNA。Survivin-shRNA(shSRV)序列為5'-gaa agt gcg ccg tgc cat c-3'，位于全長(zhǎng)Survivin編碼序列的第387～405 bp。同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照序列5'-gac ttc ata agg cgc atg c-3'。編碼shRNA的DNA(由武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司合成)結(jié)構(gòu)為:BamHⅠ+U6啟動(dòng)子+Sense DNA+Loop(ttc aag acg)+Antisense DNA+TTTTTT+BglⅡ，克隆入 pGenesil-1.1。從pGenesil-1.1中BamHⅠ+BglⅡ酶切釋放shRNA片段，插入pSG500載體的BglⅡ位點(diǎn)，構(gòu)成pSG500-shSRV;再?gòu)膒CA13-mE中BglⅡ酶切釋放mE表達(dá)盒，包括 CMV啟動(dòng)子、mE cDNA、PolyA，插入到pSG500的BglⅡ位點(diǎn)，構(gòu)建成功pSG500-shSRV-mE(同時(shí)攜帶 shSRV和 mE)。pSG500-shSRV-mE、pSG500-shSRV、pSG500-mE、pCA13-mE 分別與腺病毒包裝質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，重組出雙調(diào)控腺病毒及其一系列對(duì)照腺病毒CNHK500-shSRV(僅攜帶shSRV)、CNHK500-mE(僅攜帶 mE)、Ad-mE(非增殖型腺病毒，攜帶mE)。

1.2.2 鑒定 各腺病毒經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定E1a序列后，于293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增，氯化銫密度梯度離心純化，TCID50法檢測(cè)病毒滴度:挑取病毒克隆噬斑，提取腺病毒DNA，PCR鑒定腺病毒E1a和hTERT序列。結(jié)果顯示，CNHK500-shSRV-mE、CNHK500-shSRV、CNHK500-mE病毒克隆E1a陽(yáng)性，而Ad-mE為陰性(圖 1);CNHK500-shSRV-mE、CNHK500-shSRV、CNHK500-mE、Ad-mE 病毒滴度分別達(dá)到2.1×1010、1.1 ×1011、7.1 ×1010、4.2 ×109pfu/mL。

圖1 各腺病毒鑒定結(jié)果

1.2.3 肝癌細(xì)胞中雙調(diào)控腺病毒特異性增殖觀察收集75 cm27721細(xì)胞1瓶，傳至6孔板中，4×105細(xì)胞/孔，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。按MOI=1分別加 入 CNHK500-shSRV-mE、 CNHK500-shSRV、CNHK500-mE、Ad-mE，繼續(xù)培養(yǎng)，于感染后48 h回收，TCID50法檢測(cè)病毒滴度。結(jié)果顯示，CNHK500-shSRV-mE、CNHK500-shSRV、CNHK500-mE 均屬于腫瘤特異性增殖型腺病毒，受hTERT和HRE雙啟動(dòng)子調(diào)控，與之前的研究結(jié)果一致，即在肝癌細(xì)胞中具有高增殖活性，而在正常細(xì)胞中增殖活性較弱(P＜0.01)。與 CNHK500-mE 相比，Survivin-shRNA 序列的插入沒有影響病毒的增殖能力(圖2)。Ad-mE為非增殖型腺病毒，在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中均無增殖活性。

圖2 各腺病毒在各細(xì)胞系中增殖倍數(shù)比較

3 討論

失去手術(shù)機(jī)會(huì)的晚期肝癌不僅復(fù)發(fā)率高，且傳統(tǒng)的放療、化療效果均不明顯。近年來，基因治療在肝癌的綜合治療中越來越受到重視［3，4］，但我國(guó)已批準(zhǔn)上市的兩個(gè)腺病毒基因治療產(chǎn)品rAd-p53和H101的療效均不理想［5，6］。前者為非增殖型腺病毒，因感染癌細(xì)胞的能力有限，故介導(dǎo)基因表達(dá)的效率不高;后者為不帶治療基因的增殖型腺病毒，能在P53缺陷的癌細(xì)胞中增殖，但其僅依靠增殖發(fā)揮溶瘤作用，療效不穩(wěn)定。因此，開發(fā)特異性更高、安全性更好的增殖型腺病毒載體并篩選療效明確的治療基因，成為腫瘤治療領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

針對(duì)大多腫瘤細(xì)胞高表達(dá)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)、腫瘤微環(huán)境中氧分壓低的兩大特點(diǎn)，我們前期構(gòu)建了hTERT啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒E1a表達(dá)、缺氧反應(yīng)元件(HRE)調(diào)控腺病毒E1b表達(dá)的溶瘤腺病毒CNHK500，使其在雙啟動(dòng)子的調(diào)控下實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌細(xì)胞的特異性殺傷和溶解作用，療效和安全性均得到明顯提高［1，2］，成為腫瘤基因治療良好的載體。

為使CNHK500發(fā)揮更好的抗腫瘤療效，本研究克隆了小鼠Endostatin全長(zhǎng)cDNA序列插入CNHK500病毒基因組，使其在溶瘤腺病毒增殖時(shí)高表達(dá)抗腫瘤血管生成因子，抑制腫瘤間質(zhì)血管生成［7］;同時(shí)插入凋亡抑制基因 Survivin的小發(fā)卡RNA(shRNA)沉默癌細(xì)胞Survivin表達(dá)，以抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，達(dá)到提高腫瘤基因治療療效的目的［8］;實(shí)現(xiàn)了針對(duì)惡性腫瘤端粒酶陽(yáng)性和缺氧環(huán)境的雙調(diào)控作用。經(jīng)鑒定，本研究構(gòu)建的雙調(diào)控腺病毒能夠在肝癌細(xì)胞中特異性高拷貝增殖，而在正常細(xì)胞系中幾乎不增殖，實(shí)現(xiàn)了針對(duì)惡性腫瘤端粒酶陽(yáng)性和缺氧環(huán)境的雙調(diào)控作用。雙調(diào)控腺病毒的構(gòu)建成功為肝癌的基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］孫立臣.雙靶向溶瘤腺病毒攜帶內(nèi)皮抑素基因?qū)Ω伟┑囊种谱饔茫跩］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012，29(8):1529-1531.

［2］孫立臣，張柏和，張琪，等.新型增殖型腺病毒CNHK500-hγ對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2011，18(6):635-640.

［3］Chen Z，Liu N，Zhu G ，et al.Targeting of the anti-apoptotic gene survivin in human thyroid carcinoma［J］.Int J Mol Med，2012，30(3):465-472.

［4］Morandell S，Yaffe MB.Exploiting Synthetic Lethal Interactions Between DNA Damage Signaling，Checkpoint Control，and p53 for Targeted Cancer Therapy［J］.Prog Mol Biol Transl Sci，2012，110(10):289-314.

［5］Guan YS，Liu Y，He Q，et al.p53 gene therapy in combination with transcatheter arterial chemoembolization for HCC:one-year follow-up［J］.World J Gastroenterol，2011，17(16):2143-2149.

［6］Song X，Zhou Y，Jia R，et al.Inhibition of retinoblastoma in vitro and in vivo with conditionally replicating oncolytic adenovirus H101［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010 ，51(5):2626-2635.

［7］Chan SF，Wang HT，Huang KW，et al.Anti-angiogenic therapy renders large tumors vulnerable to immunotherapy via reducing immunosuppression in the tumor microenvironment［J］.Cancer Lett，2012 ，320(1):23-30.

［8］Hu Q，Li W，Hu X，et al.Synergistic treatment of ovarian cancer by co-delivery of survivin shRNA and paclitaxel via supramolecular micellar assembly［J］.Biomaterials，2012 33(27):6580-6591.