反義nm23-H1基因對白血病k562細胞株侵襲及增殖的影響

戴振聲，徐成興，黃云勝，徐森華，胡新民

(1復旦大學附屬華山醫院南匯分院，上海201399;2復旦大學附屬上海市浦東醫院)

隨著對白血病發病機制的深入了解，基因療法治療白血病成為研究熱點。nm23基因是一種腫瘤轉移抑制基因，大量研究證實，其與多種實體腫瘤(如膽囊癌、肝癌、胃癌等)的預后及轉移密切相關［1～3］;急性淋巴細胞白血病低分化細胞中 nm23-H1表達量高于相對高分化的細胞［4］。目前關于nm23基因與慢性髓性白血病相關性的研究報道較少。2012年4月～2012年10月，我們觀察了抑制慢性髓細胞性白血病細胞株K562細胞nm23-H1基因表達對細胞增殖及侵襲的影響，旨在為分子靶向治療慢性髓性白血病提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 慢性髓細胞性白血病K562細胞株(上海細胞生物研究所)。試劑:脂質體 Lipofectamin2000(Invitrogen)，G418(Sigma)，TriZol(Invitrogen)，AMV反轉錄試劑盒(Takara公司);引物由大連Takara公司合成。nm23-H1引物:5'-TrAATCAGATGGTCGGGGAT-3'， 5'-GATCTATGAATGACAGGAGG-3';退火溫度:56℃，產物長度:186 bp;β-actin 引物:5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'，5'-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3';退火溫度:54℃，產物長度:531 bp。

1.2 實驗方法

1.2.1 nm23-H1 的 RNAi重組體 pGCsinm23(以下簡稱pGCsinm23)構建及轉染 根據GenBank中報道的Nm23-H1基因的核苷酸序列(D1734)，參考siRNA的設計策略，通過基因Blast，挑選長為19個堿基的特異性寡核苷酸序列5'-CAAGTTGGCAGGAACATTA-3'，合成其發卡樣兩端配對siRNA寡核苷酸鏈，與用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后的pGC載體連接，合成pGCsi nm23。同時合成陰性對照質粒(序列為TTCTCCGAACGTGTCA)。調整K562細胞濃度為2×105個/mL，以每孔2 mL接種于6孔培養板中培養，待細胞增至70%時采用脂質體法行細胞轉染，轉染8 h后棄去轉染液，換含新鮮培養液繼續培養1 d，棄去原培養液。轉染pGCsi nm23的細胞為觀察組，轉染對照質粒的細胞為對照組。觀察組轉染48 h后熒光顯微鏡下可見細胞核內有綠色熒光，質粒轉染效率(=每高倍鏡視野熒光細胞數/同一視野下細胞數×100%［3］)約為40%。

1.2.2 觀察項目 以下項目觀察時間為轉染后48 h。

1.2.2.1 nm23-H1 表達 ①nm23-H1 mRNA 表達:采用RT-PCR法測定。分別提取兩組細胞總RNA，U-2001型紫外分光光度計定量，均取3 μg total RNA按照試劑盒反應體系逆轉錄。β-actin作為內參照，nm23-H1基因及β-actin引物序列合成均由大連Takara公司完成，序列見表1。反應條件:預變性95 ℃、5 min，94 ℃、30 s，按表1 溫度退火30 s，72℃、40 s共30個循環;72℃延伸4 min。取10 μL產物2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察nm23-H1基因表達［5］。②nm23-H1蛋白表達:采用Western blot法。分別提取兩組細胞總蛋白，細胞數量均為1.0×106。用預冷的PBS洗滌2次，加細胞裂解液在沸水中煮10 min，后離心(20 000 rpm)10 min，取上清10 μL行SDS-PAGE電泳，經硝酸纖維素膜轉移，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h后，分別與nm23-H1(1∶300)單克隆抗體、β-tubulin多克隆抗體(1∶300)4℃孵育、過夜，β-tubulin為內參照。洗滌后再分別與二抗為HRP標記的牛抗小鼠 IgG(1∶2 500，CA)作用，經ECL底物化學發光顯影。

1.2.2.2 細胞克隆形成能力 將兩組細胞接種于6孔板上，每孔為1×104個細胞，用含600 μg/mL G418的培養液進行篩選，14 d后甲醛固定細胞，姬姆薩染色20 min，沖洗染色液，觀察各平板細胞克隆形成數量。于上層膠中(1.2%低熔點瓊脂糖)加入K562單細胞懸液，滴入已鋪有下層膠(1.2%低熔點瓊脂糖)的24孔板中，每孔加5×103個細胞;培養箱培養2周;倒置顯微鏡(40×)下觀察細胞集落形成數。

1.2.2.3 細胞侵襲能力 采用 0.05%typsin/0.02%EDTA消化后分別收集兩組細胞各1×105個，稀釋成106/mL;加入100 μL細胞懸液到6-transwell小室的上室中，下室加入600 μL無血清培養液(內含有多種趨化因子);培養24 h后HE染色，輕輕用棉簽擦凈6-transwell小室上室面無侵襲性的細胞，倒置顯微鏡(200×)下隨機選擇5個視野，計數穿過8 μm微孔膜的侵襲性細胞數，取均值。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件，采用t檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 nm23-H1表達 兩組細胞株內參照β-actin擴增條帶亮度幾乎一致，但轉染組目的條帶的亮度較對照組明顯減弱(圖1)，nm23-H1 mRNA表達水平亦下調(圖2)。提示nm23-H1基因被干擾后K562細胞nm23-H1表達水平降低。

2.2 細胞克隆形成能力 轉染組及對照組克隆形成數量分別為(12.14 ±3.51)、(4.32 ±0.95)個，轉染組明顯高于對照組(圖3)。兩組細胞在軟瓊脂中生長2周左右即能形成類圓形細胞集落，與對照組比較，轉染組集落體積大且形成數量多，見圖4。提示nm23-H1基因表達下調后K562細胞軟瓊脂生長能力明顯增強。

圖1 K562細胞nm23-H1 mRNA表達

圖2 K562細胞nm23-H1 mRNA表達

圖3 K562細胞平板克隆形成情況注:A:對照組;B:觀察組

圖4 K562細胞軟瓊脂克隆形成情況(40×)注:左:對照組;右:觀察組

2.3 細胞侵襲能力 觀察組及對照組穿膜細胞數分別為(25.33 ±3.51)、(14.33 ±4.04)個，P ＜0.05(圖5)。

圖5 K562細胞穿膜情況(200×)

3 討論

目前，白血病患者在我國的發病率正逐年上升，為2.76/10萬。總發病率在腫瘤總發病率中位列第9。慢性髓細胞性白血病(CML)是臨床上一種起病及發展相對緩慢的白血病。我國的CML發病率調查結果為年發病率0.36/10萬，與亞洲國家相近，低于歐美國家。在我國CML約占各類白血病的20%，占慢性白血病的95%.發病年齡分布較廣，但發病率隨年齡的增長有逐步上升趨勢，男性發病率高于女性。直至今天，CML的治療方案只能延緩疾病進展。基因治療白血病近年來研究較多，CML是目前應用反義核酸技術研究最多的白血病。在眾多的基因中，nn23基因是近幾年來令人關注的基因之一，其表達水平與某些腫瘤的轉移和預后相關，被認為是一種腫瘤轉移抑制基因。在造血系統，nm23基因與細胞的增殖和分化活動有關，下調nn23-H1基因表達可抑制K562細胞株增殖，降低細胞的惡性程度，對于白血病患者，nm23基因表達可能是預后不良的因素［5］。本研究合成了 pGCsinm23，其轉染K562細胞后可有效抑制細胞中nm23-H1 mRNA及蛋白表達水平;轉染48 h后K562細胞形成的克隆體積增大，數量增多;且其體外侵襲能力明顯增強，提示nm23基因對K562細胞株的生長、增殖及侵襲力有明顯影響，與2005年Huang等［6］的研究結果一致，Jung等［7］認為，nm23基因表達與肝癌的侵襲和轉移性密切相關，nm23基因表達可抑制腫瘤轉移和侵襲的能力。

本研究結果提示，nm23基因是一個與白血病預后密切相關的抑制轉移基因。進一步需進行臨床患者外周血nm23基因表達與其預后及治療效果的研究。

［1］Jiang WX，Song BG，Wang PJ.Expression of nm23，KAI1 and spiral computed tomography findings in primary gallbladder carcinoma［J］.Chin Med J(Engl)，2009，122(21):2666-2668.

［2］Boissan M，Wendum D，Arnaud-Dabernat S，et al.Increased lung metastasis in transgenic NM23-Null/SV40 mice with hepatocellular carcinoma［J］.J Natl Cancer Inst，2005，97(11):836-845.

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［4］Magyarosy E，Sebestyén A，Timár J.Expresion of metastasis assaciated proteins，CD44v6 and nm23-H1，in pediatric acute lymphoblastic leukemia［J］.Anticancer Res，2001，21(1B):819-823.

［5］陳宇霞，張美英，熊盛，等.SIRNA分析rim23-H1基因與人慢性髓性白血病的關系［J］.生物工程學報，2006，22(3):403-407.

［6］Huang CS，Shih MK，Chuang CH，et al.Lycopene Inhibits Cell Migration and Invasion and Upregulates Nm23-H1 in a Highly Invasive Hepatocarcinoma，SK-Hep-1 Cells［J］.J Nutr，2005，135(9):2119-2123.

［7］Jung S，Paek YW，Moon KS，et al.Expression of Nm23 in Gliomas and its Effect on Migration and Invasion In Vitro［J］.Anticancer Res，2006，26(1A):249-258.