魚露中章魚胺的分離提取研究

曲映紅，劉志東，陳舜勝，*

(1.上海海洋大學(xué)，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海200090)

章魚胺(Octopamine，OA)，是脊椎動物激素去甲腎上腺素的一個同類物，具有對-羥苯-β-羥乙胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)，又名章魚涎胺或真硝胺，化學(xué)名為:1-(4-羥基苯基)-2-氨基乙醇，化學(xué)式為C8H11NO2，分子量為153.176。章魚胺首先由Espamer 和Boretti在章魚(Octopusvulgaris)的唾液中發(fā)現(xiàn)而得名［1］。章魚胺是一種天然的β3-腎上腺素能受體激動劑［2］，在肥胖癥的治療和II 型糖尿病的防治上有潛在的應(yīng)用價值［3］。近來來，關(guān)于章魚胺的生物活性［4-5］和檢測方法［6-7］的研究日趨活躍。天然章魚胺也存在于枳實和魚露中，且魚露中的含量相對豐富［8］。在前期實驗［9］中發(fā)現(xiàn)，利用智利外海莖柔魚內(nèi)臟釀制的魚露中章魚胺含量很高，可達6000 ～7000μg·mL-1。朱婷婷［10］研究發(fā)現(xiàn)H103 大孔吸附樹脂對魚露中章魚胺有較好的吸附分離效果，該樹脂對魚露中章魚胺的靜態(tài)飽和吸附量達2.925mg·g-1(干樹脂)，用30%的乙醇作洗脫液，洗脫率達98.04%。王敏［11］用硅膠吸附分離魷魚內(nèi)臟水解液中的章魚胺，靜態(tài)飽和吸附量為3.209mg·g-1(干硅膠)，采用30%的乙醇為洗脫劑時，洗脫率達95.32%。由于H103 大孔吸附樹脂的處理過程中要使用鹽酸、丙酮、甲醇等試劑，因此從食品安全的角度考慮，本研究選用硅膠來分離提取魚露中的章魚胺。魚露中所含的章魚胺是具有較高生物活性的純天然章魚胺，本實驗旨在探討從魚露中提取章魚胺的有效方法，以期為合理開發(fā)利用智利外海莖柔魚廢棄物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚露 以莖柔魚內(nèi)臟為原料40℃保溫速釀的魚露。制備方法如下:莖柔魚內(nèi)臟切塊、絞碎，加入鹽(加入量為莖柔魚內(nèi)臟重量的20%)、水(料液比為1∶1)，攪勻裝桶，蓋上5 層紗布，40℃保溫釀制3 個月。魚露原漿較為粘稠，先用兩層脫脂紗布過濾，再用布氏漏斗抽濾，得到澄清透明的魚露備用。章魚胺標準品(鹽酸鹽) Sigma 公司;磷酸二氫鈉、檸檬酸、氫氧化鈉、乙醇、硅膠(60～100 目，100～200 目和200～300 目) 分析純，上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站。

HWS12 型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;層析柱;智能蠕動泵;LGJ-10 臺式壓蓋型真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;SCL-10A vp 高效液相色譜儀，SPD-10A vp 紫外檢測器，SIL-10ADvp 自動進樣器，CLASS-VP 工作站 島津國際貿(mào)易(上海)有限公司;Alliance 2695 Quattro micro 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 Waters 公司。

1.2 靜態(tài)吸附性能考察

1.2.1 飽和吸附量的測定 參考文獻［11］的方法。精密稱取60～100、100～200、200～300目三種規(guī)格的硅膠各約1g，分別置于50mL 的帶蓋塑料管中，準確加入10mL 魚露，2h 內(nèi)每隔5min 震蕩10s，然后靜置24h，使硅膠達到飽和吸附。盡量不搖動試管，使硅膠保持在試管底部，小心吸取上層溶液并測定章魚胺濃度。硅膠在室溫下的飽和吸附量按下式計算:飽和吸附量=(吸附前魚露中章魚胺濃度一吸附后魚露中章魚胺濃度)×魚露體積/硅膠干重。在其后的實驗中選用吸附量最大的硅膠分離魚露中的章魚胺。

1.2.2 洗脫率的測定 參考文獻［10］的方法。從食品安全、經(jīng)濟角度及前期的研究結(jié)果綜合考慮，選用乙醇的水溶液作為洗脫劑。取7 支50mL 的帶蓋塑料管，分別加入精密稱取的硅膠(1.2.1 中吸附量最大的硅膠)約1g，準確加入魚露5mL，每隔5min 震蕩10s，共2h，然后靜置24h，分離樹脂，對應(yīng)加入濃度分別為10%，20%，30%，40%，50%，70%，90%的乙醇水溶液各20mL，每隔5min 震蕩10s，共2h，測洗脫液濃度，計算洗脫率。洗脫率(%)計算公式為:洗脫率=(洗脫液濃度×洗脫液體積)/飽和吸附量×100。在其后的實驗中選用洗脫率最大的乙醇溶液作為洗脫劑。

1.3 動態(tài)吸附性能考察

1.3.1 動態(tài)吸附 參考文獻［11］的方法。將1.2.1中靜態(tài)飽和吸附量最大的硅膠濕法裝柱，選用的層析柱直徑2cm，硅膠柱高度24cm，故柱體積約75mL。用智能蠕動泵控制魚露以1BV·h-1的流速上柱。收集柱底流出的魚露，每50mL 取最后1mL，用HPLC法測定章魚胺含量。

1.3.2 動態(tài)洗脫 參考文獻［12］的方法。達到飽和吸附的硅膠柱底以蠕動泵抽5min，除去可能殘存的魚露，以前述靜態(tài)洗脫時洗脫率最大的乙醇溶液作為洗脫劑，用蠕動泵控制其流速為1BV·h-1，收集洗出液，每5mL 一管，測定各收集管洗出液中章魚胺的濃度。

1.4 章魚胺的精制和定性鑒定

將收集的各管洗出液混合在一起，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約10mL，采用島津SCL-10A vp HPLC 分離系統(tǒng)進行精制，色譜條件為:采用Sepax HP-C18(21.2mm ×250mm，10μm)色譜柱，流動相為0.02mol·L-1檸檬酸-0.02mol·L-1磷酸二氫鈉(7 ∶3)，pH3，流速10mL·min-1，檢測波長274nm。收集出峰時的流出液，真空冷凍干燥后用質(zhì)譜做定性鑒定。

將章魚胺標準品和凍干后得到的白色粉末狀物質(zhì)分別配制成1ppm 的甲醇溶液進行質(zhì)譜分析。使用高分辨率質(zhì)譜可得知離子的精確質(zhì)量數(shù)，然后以參照物作峰匹配可以確定分子式和分子量。使分子和離子中的各種化學(xué)鍵斷裂后可形成碎片離子，籍此可推斷出分子和離子的裂解方式，從而得到它們的結(jié)構(gòu)信息。本研究所采用的質(zhì)譜條件是:電噴霧離子源(ESI)，溫度120℃;脫溶劑氣和錐孔氣N2;脫溶劑氣流速500L h-1，脫溶劑溫度350℃;錐孔電壓20V，錐孔氣流速50L·h-1;毛細管電壓3.50kV;碰撞氣體氬氣;掃描方式為正離子掃描;碰撞能量分別為5、10、20eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅膠對魚露中章魚胺的靜態(tài)吸附

三種不同目數(shù)的硅膠對魚露中章魚胺的靜態(tài)飽和吸附量如圖1 所示。結(jié)果表明:60～100、100～200、200～300目的硅膠對魚露中章魚胺的飽和吸附量分別為:3.8372、3.0429、1.6539mg·g-1(干硅膠)。可以看出，60～100目硅膠對魚露中章魚胺的飽和吸附量明顯高于其他兩種硅膠，因此在后續(xù)實驗中選用60～100目硅膠分離魚露中的章魚胺。

圖1 三種規(guī)格的硅膠對魚露中章魚胺靜態(tài)飽和吸附性能比較Fig.1 Comparison of statically saturated adsorption performance on the three kinds of silica gel

2.2 乙醇洗脫劑濃度的選擇

以乙醇水溶液為洗脫劑時測得的靜態(tài)洗脫率詳見表1。結(jié)果表明隨乙醇濃度的增加，章魚胺的洗脫率很快上升，以30%乙醇為洗脫劑時的洗脫率最高，達90.48%，之后隨濃度增大洗脫率降低。據(jù)此，在動態(tài)洗脫時就選用30%乙醇水溶液作為洗脫劑。

2.3 硅膠對魚露中章魚胺動態(tài)吸附性能的研究

60～100目硅膠對魚露中章魚胺動態(tài)吸附結(jié)果見表2，當60～100目硅膠處理的魚露為硅膠本身的2BV 時，即上樣魚露體積為150mL 時，上樣后魚露中的章魚胺濃度為1.546mg·mL-1;上樣魚露體積300mL(4BV)時，上樣后魚露中的章魚胺濃度為4.112mg·mL-1;發(fā)現(xiàn)在上樣量在300～350mL 時，上樣后魚露中的章魚胺濃度已接近上樣前濃度，可認為硅膠對章魚胺的吸附已接近飽和，故認為60～100目硅膠對魚露中章魚胺動態(tài)吸附的最佳上樣量為4BV。

表1 洗脫劑的不同濃度對洗脫率的影響Table 1 Effect of different eluent concentration on the elution rate

表2 60～100目硅膠對章魚胺的動態(tài)吸附效果Table 2 Dynamic adsorption capacity of 60～100mesh silica gel for octopamine

2.4 硅膠對魚露中章魚胺的動態(tài)洗脫

以洗出液體積為橫坐標，以洗出液中章魚胺濃度為縱坐標作圖可說明洗脫液(30%的乙醇溶液)對硅膠柱上章魚胺的動態(tài)洗脫情況，如圖2 所示。從圖中可以看出，洗出液體積達到40mL 時，洗出液中章魚胺濃度達到最大值，并隨洗脫液體積的增加而逐漸下降，到75mL 時洗出液中的章魚胺濃度已降至0.5mg·mL-1以下，這時可以認為硅膠柱上吸附的章魚胺已基本上被洗脫下來，此時洗脫液上樣量為82.5mL，即1.1BV。

圖2 硅膠對章魚胺的動態(tài)洗脫曲線Fig.2 Dynamic desorption curve of silica gel for octopamine

2.5 精制凍干后章魚胺的質(zhì)譜分析

章魚胺標準品和提取得到的章魚胺凍干樣品分別被不同的碰撞能量轟擊，得到的質(zhì)譜圖如圖3 和圖4 所示，其中圖3a～圖3c 分別為碰撞能量為20、10、5eV 時章魚胺標準品的質(zhì)譜圖，圖4a～圖4c 分別為碰撞能量為20、10、5eV 時章魚胺凍干樣品的質(zhì)譜圖。由圖中可以看到章魚胺凍干品與標準品的質(zhì)譜圖基本一致，因此可認為凍干后得到的物質(zhì)為純度較高的章魚胺。

圖3 章魚胺標準品質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of octopamine standard

圖4 章魚胺樣品質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of octopamine sample

3 結(jié)論

本實驗利用智利外海莖柔魚內(nèi)臟為原料，經(jīng)保溫速釀制備魚露，再經(jīng)硅膠柱吸附、乙醇洗脫、高效液相色譜精制并凍干后，得到了較高濃度的天然章魚胺粉末。本研究發(fā)現(xiàn)60～100目硅膠對魚露中章魚胺的靜態(tài)飽和吸附量達3.837mg·g-1(干硅膠)，以30%的乙醇為洗脫劑時，洗脫率達90.48%。60～100目硅膠對魚露中章魚胺動態(tài)吸附的最佳上樣量為4BV，動態(tài)洗脫時用1.1BV 洗脫液可基本洗脫完全。

魚露中章魚胺的含量較為豐富，高于其他許多水產(chǎn)品。從魚露中有效提取章魚胺并進行精制，可以為進一步開發(fā)利用天然章魚胺打下基礎(chǔ)。從智利外海莖柔魚內(nèi)臟速釀魚露中提取章魚胺，可使廢棄物得以綜合利用，減少資源浪費和環(huán)境污染。實驗過程中所用硅膠、洗脫劑等安全無毒，可為制備食用級的章魚胺產(chǎn)品提供依據(jù)。

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