一株章魚腸道共生菌的篩選鑒定及抑菌譜研究

鄧加聰，鄭 虹，陳文韜

(福建師范大學福清分校，福建福清350300)

微生物資源及其產生的活性化合物是地球上最為豐富的自然資源之一，是藥物發現的重要來源。在目前陸地微生物發現新藥幾率急劇下降的形勢下，海洋微生物次生代謝產物特別是海洋稀有放線菌已成為作用機制新穎、化學結構多樣化的新藥先導化合物的來源［1-3］。目前我國對海洋稀有放線菌及其產生的活性化合物研究不多，總體水平較低。但是，有關海洋生物產生新的生物活性物質的報道逐漸增多，已經從海洋微生物中發現了許多結構新穎的化合物，這些化合物具有較高的抗腫瘤活性。海洋放線菌是海洋細菌抗腫瘤活性物質的重要來源，最先成為海洋微生物研究的熱點［4-6］。動物腸道微生物對于特定的動物生長發育而言是一種整體的、全面的、平衡的群體。近年來，隨著對腸道共生菌研究的不斷深入，腸道共生菌的多種生物學功能不斷被發現，如腸道共生菌產生的多種抗生素對多種植物及人類病原菌有廣泛的抑菌活性;產生的殺蟲毒素對許多害蟲有較強的致死作用等，體現出廣闊的開發利用前景［7-9］。因此，對動物腸道中海洋微生物的研究具有很好的發展前景，為尋求新的藥物或者抑菌物，本文對無脊椎動物章魚腸道中的共生菌進行篩選、觀察、16S rDNA 鑒定、抑菌譜研究等，來了解章魚腸道中共生菌的抑菌情況，以便進一步開發研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活章魚 購買自自福清市東壁島海產品市場;大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)、白色念珠菌(Monilia albicans)、短小桿菌(Bacillus pumilis)、青枯病菌(Bacterial wilt)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、青霉、木霉、根霉、黑曲霉、黃曲霉、玉米病菌 福建師范大學福清分校生化系微生物實驗室提供;Taq 酶、dNTP、瓊脂糖、DNA 純化試劑盒等藥品 購自上海生物工程有限公司;牛肉膏蛋白胨培養基、PDA 蔗糖培養基、高氏I 號培養基 購自上海國藥集團化學試劑有限公司;分離培養基、發酵培養基、燕麥粉瓊脂培養基、無機鹽淀粉培養基、酵母膏-麥芽糖培養基、查氏培養基 參照文獻《微生物學實驗教程》［10］配方自主配制。

生化培養箱SPX-150B-Z 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;超凈工作臺SW-CJ-IFD 蘇州安泰空氣技術有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KB 上海申安醫療器械廠;大容量恒溫振蕩器THZ-25 太倉市華美生化儀器廠;臺式低速大容量離心機L-550 湘儀離心機有限公司;PCR 儀 美國Bio-rad 公司;水平電泳槽 北京六一儀器廠;電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9070A 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海洋腸道抗菌性放線菌的篩選 章魚表面用75%酒精消毒，在超凈工作臺上進行解剖，取其腸道作為樣品，將樣品剪碎、混合，備用;稱取1g 樣品放入裝有9mL 無菌水的試管中，稀釋度即為10-1，按10倍稀釋法進行梯度稀釋，稀釋度為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7;分別吸取不同梯度的稀釋液0.2mL，涂布于裝有分離培養基的平板，每個稀釋度涂布3個平板，于28℃培養箱中倒置培養5～7d;挑取菌落大的菌株劃線分離培養基，挑取單菌落接種于試管斜面28℃培養，并于4℃冰箱保存，備用。

1.2.2 抗菌性放線菌的復篩 將初篩得到的菌株接種于發酵培養基，30℃150r/min 振蕩培養72h，以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用雙層平板透明圈法測定發酵液的抑菌作用。

每株菌重復3 個平行實驗。

1.2.3 菌株D-8 的培養與生理生化特征的確定 參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》［11］、《放線菌快速鑒定與系統分類》［12］等相關文獻對菌株的形態、培養及生理生化特性進行鑒定。

1.2.4 16S rDNA 基因序列測定和分析

1.2.4.1 菌株基因組DNA 的提取 將活化后的菌株采用堿提取法提取菌株D-8 基因組DNA［13-14］。

1.2.4.2 16S rDNA 的PCR 擴增和測序 根據16S rDNA 的保守區設計擴增引物，正向引物16s-F:5'-AGAGTTTGATCATGGCCTCAG-3';反向引物16s-R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR 反應體系(50μL)為:10 ×Tap Buffer 5μL、dNTP 1μL、PCR 引物各1μL、Taq 酶1μL、DNA 模板1μL，加無菌雙蒸水至50μL。PCR 反應條件為:94℃預變性5min，94℃30s，55℃ 30s，72℃延伸1min，循環 35 次，72℃10min。16S rDNA 擴增產物用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，產物用試劑盒純化后進行測序。

1.2.4.3 系統進化樹的構建 測序結果與Ncbi 的GenBank 中已知序列進行比對，用MAGE5.2 軟件以N-J 法構建進化樹，進行系統發育分析。

1.2.5 菌株抑菌性實驗及其抑菌譜實驗1.2.5.1 抑菌性實驗 采用雙層平板透明圈法［15］。培養皿中加入10mL 牛肉膏蛋白胨培養基(下層)，搖勻鋪平，再加入7mL 牛肉膏蛋白胨培養基(60℃左右含有指示菌終濃度為106個/mL)，之后迅速放入滅過菌的牛津杯，完全凝固后備用。每個杯中加入200μL 樣品，36℃下培養24h，觀察并測量透明圈的直徑。

1.2.5.2 抑菌譜實驗 抗細菌活性實驗:雙層平板透明圈法(同上);抗絲狀真菌活性實驗:采用濾紙片法［16-17］，將指示菌點接于PDA 平板培養基上，28℃下培養24～36h，待菌落長到約5cm 左右，將浸泡有樣品的濾紙片(直徑:5mm)放至菌落外圍0.5cm 處，以無菌蒸餾水為對照，28℃培養24h，觀察結果。

2 結果與分析

2.1 章魚腸道放線菌的篩選及菌株形態觀察

2.1.1 章魚腸道放線菌的篩選 經過稀釋涂布及劃線分離等方法，從新鮮章魚腸道中篩選到12 株菌落大、抑菌活性較高的放線菌，結果見圖1。

圖1 不同菌株抑菌性的比較Fig.1 The compare of different strains’antibacterial

由圖1 可見，菌株8 的透明圈直徑最大，為2.61cm，說明菌株8 的抑菌活性最高。不同菌株間抑菌性的高低如下:D-8 ＞D-6 ＞D-10 ＞D-12 ＞D-2＞D-1 ＞D-11 ＞D-3 ＞D-5 ＞D-9 ＞D-7 ＞D-4，因此選擇菌株8 進行下列實驗。

2.1.2 放線菌菌株形態觀察及生理生化鑒定 參見文獻《放線菌快速鑒定與分類系統》對菌株D-8 進行菌株形態及生理生化實驗。結果見圖2、表1、表2。

圖2 放線菌D-8 的形態特征Fig.2 Actinomycetes’(D-8)morphological characteristics

由圖2 可見，該菌株在高氏Ⅰ號固體培養基上菌落較小，乳白色，干燥，不透明，難挑取。在顯微鏡下觀察，菌株菌絲不斷裂、無橫隔、具有良好的分枝菌絲。

菌株D-8 部分生理生化鑒定結果見表1、表2，該菌株革蘭氏染色為陽性，硫化氫實驗陽性，能水解明膠、幾丁質、酪蛋白、纖維素及淀粉，糖發酵實驗中不利用棉子糖;該菌株在不同培養基上的菌落形態有所差別，在無機鹽淀粉培養基上生長會產生黃色可溶性色素，其他培養基上均不產可溶性色素。參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《放線菌快速鑒定與分類系統》中放線菌的分類方法，根據菌株的生理生化特性及在不同培養基上的菌絲特征初步判斷該菌株屬于鏈霉菌屬(Streplomyces)。

表1 菌株D-8 部分生理生化特性Table 1 Strain’s(D-8)part physiological and biochemical features

表2 菌株D-8 在不同培養基上的形態特征Table 2 Strain’s(D-8)morphological characteristics in different mediums

2.2 放線菌D-8 的16S rDNA 的測序和分析

測序獲得菌株16S rDNA 的序列大小為1542bp，將測序所得的16S rDNA 序列通過NCBI 的BLAST進行在線比對，結果表明該菌株的序列與鏈霉菌屬的多個鏈霉菌具有99%以上的同源性。根據同源性高低，隨機挑取若干個序列，采用MAGE5.2 軟件構建菌株系統進化樹，結果見圖3。

圖3 菌株D-8 的系統進化樹Fig.3 Strain’s(D-8)phelogenetic tree

從圖3 可見，菌株D-8 與鏈霉菌菌屬聚為一類，且與登陸號等鏈霉菌16S rDNA 序列的同源性最高達到99%。因此，在細菌系統發育分類學上，初步將該菌株歸屬為鏈霉菌。

2.3 菌株抑菌譜的測定

2.3.1 放線菌D-8 對細菌的抑菌譜 放線菌D-8 30℃150r/min 振蕩培養72h，發酵液4℃8000r/min離心10min 得上清液，采用雙層平板透明圈法測定上清液對各種細菌的抑菌性。結果見圖4。

圖4 放線菌D-8 對各種細菌的抑制作用Fig.4 The inhibiting effect of Actinomycetes’(D-8)to different bacterias

由圖4 可見，放線菌D-8 對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有明顯的抑菌作用，對各種指示菌抑菌作用的強弱如下:金黃色葡萄球菌＞藤黃八疊球菌＞大腸桿菌＞白色念珠菌＞枯草芽孢桿菌＞青枯病菌＞短小桿菌，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌性可達到2.63cm。表明該菌株是一株具有廣譜抑菌作用的菌株。

2.2.2 放線菌D-8 對真菌的抑菌譜 放線菌D-8 30℃150r/min 振蕩培養72h，發酵液4℃8000r/min離心10min 得上清液，采用濾紙片法測定上清液對各種真菌的抑菌性，以濾紙片周圍的透明圈大小為判定該菌株對指示菌抑菌作用的強弱。結果見表3。

表3 放線菌D-8 對各種真菌的抑制作用Table 3 The inhibiting effect of Actinomycetes’(D-8)to different fungus

由表3 可見，放線菌D-8 對部分真菌有抗性，而對一些真菌無抗菌性。

3 結論

本文從章魚腸道中篩選得到一株具有抗菌活性的鏈霉菌菌株D-8。抑菌實驗結果顯示，該菌株對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有明顯的抑菌作用，對各種指示菌抑菌作用的強弱如下:金黃色葡萄球菌＞藤黃八疊球菌＞大腸桿菌＞白色念珠菌＞枯草芽孢桿菌＞青枯病菌＞短小桿菌，具有廣譜的抑菌活性。常規生理生化測試結果表明，菌落較小，乳白色，干燥，不透明，難挑取。在顯微鏡下觀察，菌株菌絲不斷裂、無橫隔、具有良好的分枝菌絲，革蘭氏染色為陽性。

從16S rDNA 基因序列相似性和系統發育樹上看，該菌株與鏈霉菌有99%以上的同源相似性，表明該菌株與鏈霉菌菌屬的親緣關系最近。綜上所述，從形態、生理生化、16S rDNA 基因序列同源性、系統發育學等方面分析，菌株D-8 可鑒定為海洋放線菌中的鏈霉菌，具有廣譜的抑菌活性。本研究為新化合物的尋找打下基礎。

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