青養(yǎng)蛋白抗氧化肽的制備及其胃腸道消化性的研究

顧 敏，趙謀明，王 茜，陳小楓，任嬌艷

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510641)

青養(yǎng)是青蛙的一種，為沼水蛙屬(Hylarana)。青養(yǎng)蛋白營養(yǎng)與林蛙相似，含有豐富的氨基酸，尤其是人體必需氨基酸種類齊全，含量高，屬低脂肪、低膽固醇的肉類［1］。我國共有青蛙180 余種［2］，人們較為熟悉的是林蛙、虎紋蛙等，而青養(yǎng)卻很少為人們所知。目前國內(nèi)外對青蛙的研究，主要集中在皮膚活性肽的提取，鑒定，基因克隆表達等［3］，約有20%集中在青蛙大腦活性物質(zhì)等的研究［4］，而對青蛙肉的研究比較少，且多集中在產(chǎn)品方面。而在青蛙類產(chǎn)品中，林蛙油的研究比較多，但是對林蛙肉的研究卻不多，主要集中在營養(yǎng)成分的分析［5］，及酶解工藝優(yōu)化等［6］，研究的不夠深入，此外，未曾查閱到與青養(yǎng)蛋白相關(guān)的研究。通過酶法加工青養(yǎng)肉蛋白可以獲得具有特殊生理機能的短肽。近年來的研究表明，食物蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中的一些短肽除營養(yǎng)功能外，還具有廣泛的生理調(diào)節(jié)功能，如抗疲勞、降血壓、降膽固醇、免疫調(diào)節(jié)、增加骨密度等［7］。食物蛋白質(zhì)酶解制備活性短肽研究已成為食品科學界和醫(yī)藥學界的關(guān)注點。本實驗采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、風味酶四種酶水解青養(yǎng)蛋白，探討各種酶對酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)利用率和水解度的影響，并研究各種酶水解產(chǎn)物的理化特性，包括氨基酸組成、分子量分布、DPPH·清除能力、ORAC 差異，篩選出制備青養(yǎng)抗氧化肽的最佳用酶，且在此基礎(chǔ)上研究了抗氧化肽的胃腸道消化特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活青養(yǎng)(平均重56 ±3.1g，長12 ±5cm) 購于廣州黃沙水產(chǎn)批發(fā)市場，脂肪含量為1.13% ±0.04%，蛋白含量為16.91% ±0.44%，去皮去頭去內(nèi)臟洗凈后絞成肉糜，置于-20℃冰箱中冷凍，備用;木瓜蛋白酶(6 ×105U/g)、堿性蛋白酶(2000U/mL)、胰酶(1500U/mg)和風味酶(2 × 105U/g) 購于Novozymes(諾維信)公司;凝膠層析標準樣品:細胞色素C(12384u)，Approprinin(6512.42u、維生素B12(1355u)、谷胱甘肽(612.64u)和 Gly - Gly - Gly(189.17u) 均購于美國Sigma 公司。DPPH 自由基(1，1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl)、熒光素(FL)、抗氧化標準物Trolox、2，2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH) 均購于Sigma 公司;其他試劑為國產(chǎn)分析化學純。

MM12 型絞肉機 廣東省韶關(guān)市食品機械廠;UV-754 分光光度計上海精密科學儀器有限公司;KDN-2C 型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;KDN-40 消化爐 上海新嘉電子有限公司;GL-21 M高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;酶標儀 光譜掃描多功能讀數(shù)儀 Thermo scientific(芬蘭);電子天平 Mettler Toledo 儀器(上海)有限公司;超純水系統(tǒng) 廣州潔圣膜技術(shù)有限公司;XW-80A 渦旋混合儀 上海精科實業(yè)有限公司;PHS-3C精密pH 計 上海雷磁精密儀器廠;A300 全自動氨基酸分析儀 德國membraPure 公司;Amersham 蛋白質(zhì)分析純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare 公司。

1.2 酶解工藝流程［8］

青蛙肉糜樣品:離子水(1∶1)→加酶(酶量0.15%，酶解4h)→滅酶(95℃，10min)→快速冷卻至室溫，低溫離心(6000r/min，20min)→取上清液→冷凍干燥［8］。

木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和風味酶的酶解溫度是55℃，胰酶的酶解溫度是37℃;木瓜蛋白酶和風味酶的酶解pH 為自然pH，堿性蛋白酶和胰酶的酶解pH 為8.0。

1.3 模擬胃腸消化道酶系對青養(yǎng)多肽抗氧化活性的影響

體外模擬胃腸消化道酶系的反應參考Cinq-Mars 等人［9］的方法并有所改進，整個模擬過程分兩步反應進行:

第一步，模擬胃消化道酶系的消化過程。青養(yǎng)多肽粉復溶于去離子水中配成3%(w/w)的溶液，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)體系的pH 至2.0。加入胃蛋白酶(加量為青養(yǎng)蛋白含量的4%)，適度攪拌，然后在搖床中37℃恒溫孵育2h。在此過程中，在0、0.5、1.0、1.5、2.0h分別取樣，置于沸水浴中滅酶10min，迅速冷卻，離心(6000r/min，15min)，冷凍干燥，以測定多肽經(jīng)胃蛋白酶消化后其抗氧化活性的變化。

第二步，模擬腸消化道酶系的消化過程。青養(yǎng)多肽經(jīng)過胃消化道酶系消化2h 后，用1.0mol/L 氫氧化鈉調(diào)pH 至7.5。然后加入胰酶(加量為青養(yǎng)蛋白含量的4%)，適度攪拌，然后在搖床中37℃恒溫孵育2h。在此過程中，分別在2.5、3.0、3.5、4.0h 處取樣，置于沸水浴中滅酶10min，快速冷卻，離心(6000r/min，15min)，冷凍干燥，以測定多肽經(jīng)腸消化道后其抗氧化活性的變化。

1.4 實驗測定方法

1.4.1 蛋白質(zhì)利用率的測定 用凱氏定氮法［10］分別測定肉糜原料和酶解液中蛋白氮含量，并按下式計算:

1.4.2 水解度的測定［11］水解度的測定方法采用甲醛滴定法，并按下式計算:

式中，AN 為青養(yǎng)酶解液中游離氨基氮的含量，g/100g;AN0為青養(yǎng)肉糜液酶解前游離氨基氮的含量，g/100g;N 為青養(yǎng)原料中總蛋白氮的含量，g/100g。

1.4.3 肽分子量分布情況 標準肽樣品:Globin III(分子量為2512)、GlobinⅡ(分子量為6214)、Globin I(分子量為8519)、Globin I +III(分子量為10700)、Globin I + Ⅱ(分子量14404)、Globin(分子量為16949)，美國Amersham 公司。分離柱為Superdexpeptide 30/100GL，預裝柱(Vt= 24.0mL，Vo=8.0mL)，進樣體積為100μL，檢測波長設(shè)為214nm，最大壓力設(shè)為1.8MPa。洗脫液為0.25mol/LNaCl，pH7.2 磷酸緩沖液，洗脫流速為0.5mL/min，分子量與保留體積的關(guān)系為y =-0.0578x +4.6289，R2=0.99，y 為標準肽分子量的對數(shù)，x 為洗脫體積，mL。

1.4.4 氨基酸分析 用A300 全自動氨基酸分析儀進行青養(yǎng)酶解物的氨基酸組成分析。樣品用6mol/L的鹽酸在110℃條件下消化24h，定容到50mL，取2mL 溶液揮干，接著用稀釋液溶解，溶液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，氨基酸的含量用g/100g 表示。

1.4.5 水解產(chǎn)物清除DPPH·的測定 將2mL DPPH·溶液(0.2mmol/L，溶于95%乙醇)置于試管中，加入2mL 酶解液，振蕩混勻，室溫暗室反應30min 后，若出現(xiàn)沉淀，6000r/min 離心15min，取上清液在517nm處測其吸光值(Ai)，空白為2mL 95%乙醇加入2mL蒸餾水調(diào)零，對照為2mL DPPH·溶液加上2mL 蒸餾水在測定波長下的吸光值(Ac)，酶解液在測定波長的吸光值為A［12］j。酶解液對DPPH·的清除能力用抑制率R 表示:R(%)=［1-(Ai-Aj)/Ac］×100。

1.4.6 氧自由基吸收能力(ORAC)實驗 ORAC 測定方法，參照Blanca Hernndez-Ledesma［13］等人的方法，并作適當修改。在96 孔熒光板各微孔中加入待測樣品20μL(將Trolox 用相應的緩沖液適當稀釋)，接著加入75mmol/L 磷酸鹽緩沖液和70nmol/L FL各20μL，并將微孔板置于酶標儀中，在37℃下孵化15min 后，用多道移液器迅速在各孔中加入12mmol/L AAPH 140μL 啟動反應，在37℃以激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長520nm，每2min 測定一次各微孔的熒光強度，測定時間設(shè)在熒光衰減呈基線后為止，即設(shè)2h。

1.5 統(tǒng)計分析

除定量描述分析外，所有實驗均重復3 次，實驗結(jié)果表述為平均值±標準偏差，方差分析采用SPSS軟件(11.5 版本，SPSS 公司，美國)中的One-Way ANOVA 進行分析，p ＜0.05 為統(tǒng)計學上有顯著性差異。采用Origin8.0 作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶對蛋白質(zhì)利用率、水解度和抗氧化活性的影響

分別采用木瓜蛋白酶、風味酶、堿性蛋白酶和胰酶水解青養(yǎng)蛋白，四種酶的酶解條件相同，測定各水解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)回收率、水解度和抗氧化活性，結(jié)果見圖1～圖4。由圖1 可知，四種酶中木瓜蛋白酶酶解的水解度最高，風味酶次之，胰酶最低，只有7.14%;圖2 可知，四種酶中木瓜蛋白酶水解的蛋白質(zhì)回收率最高，達到61.20%，堿性蛋白酶次之，胰酶最低;由圖3 可知，捕獲DPPH·的能力，胰酶水解物的能力最強，風味酶次之，其IC50值為6.93mg/mL;由圖4 可見，木瓜蛋白酶酶解物的ORAC 值最高，達到801.69μmoL TE/mg，風味酶次之，由于期望蛋白質(zhì)利用率和抗氧化活性都能達到較好的狀態(tài)，所以使用風味酶和木瓜蛋白酶復配酶解，按1∶1 的比例添加，酶的使用量分別為0.1%，酶解溫度為55℃，酶解結(jié)果如圖1～圖4 中所示，青養(yǎng)蛋白的水解度提高到了18.93% ±0.12%，蛋白回收率相對風味酶也有了較大的提高，DPPH·清除能力相對木瓜蛋白酶水解物提高了，ORAC 值相對風味酶液提高了。

圖1 不同酶酶解青養(yǎng)蛋白水解度的比較Fig.1 Comparison of hydrolysis degree of different enzymes

圖2 不同酶酶解青養(yǎng)蛋白回收率的比較Fig.2 Comparison of protein recovery of different enzymes

2.2 最佳抗氧化水解物的氨基酸組成及營養(yǎng)評價

圖3 不同酶的水解物捕獲DPPH·的能力比較Fig.3 Comparison of scavenging activity on DPPH·of different hydrolysates

圖4 不同酶的水解物的ORAC 值比較Fig.4 Comparison of ORAC value of different hydrolysates

青養(yǎng)蛋白抗氧化肽中必需氨基酸與總氨基酸的比值(EAA/TAA)為45.06%，但是由于氨基酸的測定方式采用的是酸水解的模式，色氨酸被酸破壞無法測定，導致必需氨基酸的含量偏低，因此EAA/TAA 的比值應高于45.06%;必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)為82.01%，同理，真實的比值應高于82.01%，均超過了FAO/WHO 制定的蛋白質(zhì)評價氨基酸標準模式，EAA/TAA 為40%，EAA/NEAA 為60%，說明青蛙蛋白抗氧化肽是人體補充必需氨基酸的優(yōu)質(zhì)多肽食品。同時，富含具有抗氧化活性的氨基酸，如，Met、Tyr、Phe、His、Lys、Arg、Pro 等［14］。

表1 青養(yǎng)蛋白木瓜蛋白酶和風味酶復配酶解產(chǎn)物氨基酸分析Table 1 Amino acid composition of frog protein hydrolysate using papain and Flavorzyme

2.4 酶解產(chǎn)物的分子量分布

木瓜蛋白酶和風味酶復配酶解青養(yǎng)蛋白產(chǎn)物的分子量分布如圖5 所示。圖5 表明，多肽組分分子量分布主要集中在3ku 以下，高達73%，分子量高于10ku 的含量為3%，可以看出酶解效果較好，小分子肽為主要成分。據(jù)Aleman 等人研究發(fā)現(xiàn)，小分子量的肽段具有更好的抗氧化活性［15-16］，可能是因為小分子肽更易于與自由基結(jié)合，從而中斷自由基鏈式反應，在捕獲DPPH·方面，分子大小的影響更為顯著，主要是因為自由基分子含有三個苯環(huán)，活性中心位于三個苯環(huán)間隙中，若抗氧化物質(zhì)體積大，則無法靠近自由基的活性中心，從而無法阻斷自由基反應。因此可以看出青養(yǎng)水解物有作為抗氧化食物的潛力。

圖5 青養(yǎng)蛋白酶解產(chǎn)物的分子量分布Fig.5 Peptide molecular weight distribution of frog protein hydrolysate

2.5 模擬胃腸消化道酶系對青養(yǎng)多肽抗氧化活性的影響

2.5.1 模擬胃腸消化過程中青養(yǎng)多肽清除DPPH·能力的變化 如圖6所示，消化0h 時青養(yǎng)多肽對DPPH·自由基的清除率為17.20% ±4.8%。經(jīng)過胃蛋白酶消化0.5h 后，其清除率提高到51.09% ±2.01%(提高了3 倍)，進一步用胃蛋白酶進行消化，清除DPPH·自由基的能力仍在進一步的提升，但1.5h 后，清除率有所下降。在第2.0h 開始模擬腸道消化過程，青養(yǎng)多肽經(jīng)胰酶消化0.5h 后，清除DPPH·自由基顯著下降到19.13% ±0.25%(p ＜0.05);消化2.0h 后，青養(yǎng)多肽的清除DPPH·自由基能力為16.70% ±1.53%。由酶空白樣可以看出，酸堿處理的過程中，清除DPPH·自由基的能力變化不大，可能是因為酸的強度不夠，影響較小。因此，推斷消化樣品抗氧化能力的變化主要是由消化酶所引起的。因為在胃蛋白酶消化過程中，大分子肽鏈降解為小分子，更多的疏水性氨基酸殘基暴露在外［17］，使得多肽更容易接近并捕獲疏水性的DPPH·自由基。而胰酶消化過程中抗氧化能力的降低可能是因為在胰酶與多肽進一步作用，使得青養(yǎng)多肽進一步被降解，生成更短的小肽和游離氨基酸，產(chǎn)物具有較強的親水性。青養(yǎng)多肽模擬消化產(chǎn)物極性的增加使得它捕獲脂溶性的DPPH·自由基變難［17］。因此，青養(yǎng)多肽的DPPH·自由基清除能力在胰酶消化階段顯著降低。

圖6 模擬胃腸消化中青養(yǎng)多肽清除DPPH·自由基能力的變化(6mg/mL)Fig.6 Changes in DPPH·radical scavenging activity of frog peptides during sequential in vitro digestion(6 mg/mL)

2.5.2 模擬胃腸消化過程中青養(yǎng)多肽ORAC 值的變化 如圖7 所示，消化0h 時，青養(yǎng)多肽的ORAC 值為(511.86 ± 16.30)μmoLTE/mg，經(jīng)胃蛋白酶消化0.5h 后，其捕獲氧自由基能力(ORAC)提高到(618.22 ± 17.52)μmoLTE/mg(提高了21%)(p ＜0.05)，胃蛋白酶繼續(xù)消化時ORAC 值開始顯著下降。1.5～4.0h 之間的消化，ORAC 值無顯著變化，基本維持在510μmoLTE/mg 左右(p ＞0.05)。酶空白樣的ORAC 值也維持在450 ～500μmoLTE/mg 之間，只在酸處理0.5～1.0h 之間，ORAC 值有一個顯著降低的過程(p ＜0.05)，此后的ORAC 值無顯著性差異(p ＞0.05)，可能是因為酸堿的處理時間較短，且強度較小，所以對多肽的影響較小。因此推斷，消化樣品的ORAC 值在0～0.5h 之間的顯著變化，主要是由于胃蛋白酶對青養(yǎng)多肽的降解作用，使得更多的疏水性氨基酸殘基暴露在外［17］，產(chǎn)物更易于捕獲氧自由基。而消化0.5～1.5h 時，ORAC 值顯著下降(p ＜0.05)，可能是因為原本青養(yǎng)多肽的分子量不大，再進一步降解，產(chǎn)生的小肽捕獲氧自由基的能力不強。這與水解度與抗氧化活性非正相關(guān)的觀點相符合。

圖7 模擬胃腸消化中青養(yǎng)多肽ORAC 值的變化Fig.7 Changes in ORAC value of frog peptides during sequential in vitro digestion

3 結(jié)論與討論

3.1 木瓜蛋白酶和風味酶復配酶解，可以得到較優(yōu)的酶解產(chǎn)物。相對于單酶，一般復配酶解會提高水解度，因為不同的酶酶切位點有差異。

3.2 復配酶酶解產(chǎn)物的氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，青養(yǎng)蛋白酶解物具有較高的營養(yǎng)價值，且抗氧化性氨基酸的含量也較高，因此青養(yǎng)蛋白水解物是一個營養(yǎng)豐富且抗氧化活性較好的食物。

3.3 復配酶解所得產(chǎn)物經(jīng)分子量分析發(fā)現(xiàn)，小分子占多數(shù)，由于小分子量的肽段具有較好的抗氧化潛能，且易于被人體直接吸收，表明產(chǎn)物可以作為較好的抗氧化劑。

3.4 模擬胃腸道消化過程中，青養(yǎng)多肽的抗氧化活性在0～2.0h 之間活性變化較大，尤其是在0.5～1.0h之間得到的產(chǎn)物，抗氧化活性提高的較多，這可能是胃蛋白酶作用于大分子多肽，適度降解提高了活性;2.5～4.0h 為胰酶消化得到的抗氧化肽的抗氧化活性均低于胃蛋白酶消化產(chǎn)物，且產(chǎn)物之間的活性無顯著性差異，表明胰酶對多肽的降解作用不強。對于消化過程中的機理，有待在分子水平上進一步研究。

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