響應面法優(yōu)化香櫞果膠提取工藝

牛麗影，李大婧，劉春泉，*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014;2.國家農(nóng)業(yè)科技華東(江蘇)創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品工程技術研究中心，江蘇南京210014)

香櫞(Citrus wilsonii Tanaka)為柑橘屬植物，樹形優(yōu)美，果實氣味芳香清靈［1］。香櫞在中國已有兩千余年的栽培歷史，是一種藥食同源的經(jīng)濟作物，其干燥果實為我國傳統(tǒng)中藥，可用于多種復方制劑。國內外關于香櫞的研究較少，僅有少量植物學分類［2］、中藥學鑒定［3-4］、栽培繁育［5］的報道，而國外僅有其近緣種枸櫞(Citrus medica L.)精油成分及生物活性［6］的報道。目前，香櫞在我國作為園林觀賞植物廣為栽培，尤其在江蘇省靖江市，香櫞作為市樹，實現(xiàn)規(guī)模化種植，2012 年果實產(chǎn)量達到3000t 左右，為實現(xiàn)資源的充分利用，當?shù)匮兄频南銠达嬃弦蚱淝逅巳说目诟屑跋銡馐艿綇V大消費者的歡迎［7］。但是加工飲料后，大量果皮果渣的利用成為迫切需要解決的問題。從柑橘類果皮果渣中提取果膠一直是重要的果膠來源，果膠作為一種天然線性高分子化合物，具有良好的凝膠性和乳化穩(wěn)定性，并具有抗腹瀉、抗癌、減肥和治療糖尿病等作用，可廣泛用于食品、醫(yī)藥、日化產(chǎn)品中［8-9］。果膠提取的方法有多種，目前商業(yè)上多采用在加熱條件下，利用稀酸使細胞壁中的果膠釋放，再用乙醇沉淀收集果膠［10-11］。在提取工藝優(yōu)化方法中，響應面法能夠在小區(qū)域內用簡單的一次或二次多項式模型來擬合因素與結果間的全局函數(shù)關系，從而得到準確有效的結論［12］。因此，為確定香櫞果膠提取參數(shù)的優(yōu)化，本研究采用響應面法進行實驗設計，系統(tǒng)研究了影響果膠得率的主要因素及其相互關系，并采用響應面法擬合得到回歸方程，優(yōu)選出優(yōu)化工藝條件，為工業(yè)生產(chǎn)開發(fā)提供有價值的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香櫞鮮果 江蘇省靖江市，手工分離的香櫞果皮在60℃烘箱烘干，研磨機磨粉，過20 目篩，備用;無水乙醇 南京化學試劑有限公司。

HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司;TDL-5-A 型大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;PHS-5 型pH 計 上海康儀儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方法 稱取香櫞果皮粉1.0g 于50mL 離心管內，按照設定料液比加入蒸餾水，用6mol/L 的鹽酸調節(jié)pH 至設定值，置于設定溫度水浴，至設定時間取出離心，取上清液按照體積比1∶1 加入無水乙醇，離心得到沉淀出的果膠。將醇沉得到的果膠加入無水乙醇20mL，攪拌再離心除去醇溶性雜質，用無水乙醇洗滌至離心后的上清液穆立虛反應［13］為陰性，然后將得到果膠在250mL 容量瓶用水定容，參照龐榮麗等的方法［14］，利用硫酸-咔唑比色法計算果膠含量。上述過程中離心條件均為5000 ×g，15min。

1.2.2 單因素實驗 首先在pH 為1.8，85℃提取2.5h 條件下，研究不同液固比(15mL/g、20mL/g、25mL/g、30mL/g)對得率的影響，其次在優(yōu)選的液固比及85℃提取2.5h 條件下，分析不同pH(0.8、1.8、2.3、2.8、3.0)對果膠得率的影響，最后在優(yōu)選的液固比和pH 下，分別在65、75、85、95℃溫度下進行水浴，管內溫度達到各設定溫度后開始計時，計時滿0.5h 后每間隔0.5h 取出離心管，自來水沖涼至室溫，至計時3.0h，即各溫度下均有六個不同酸解時間的樣品，得到各溫度下果膠得率隨時間變化的曲線。以上實驗每個處理均進行三次重復。

1.2.3 果膠得率計算方法 以萃取得到的果膠得率作為度量標準，公式為:

式中:x1-果膠質量，g;m-果皮粉質量，g。

1.2.4 響應面法實驗設計 對料液比、萃取pH、萃取溫度(℃)、萃取時間(h)四個影響萃取率的主要因素進行優(yōu)化實驗。Box-Behnken 設計的四因素三水平編碼表如表1 所示。根據(jù)實驗方案進行實驗后，對實驗數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，求得回歸方程。

表1 實驗因素水平編碼表Table 1 Code and levels of factors design for experiment

1.3 數(shù)據(jù)分析

單因素實驗數(shù)據(jù)應用采用Origin Pro7.5(Origin Lab Corp.，Northampton，MA，USA)進行單因素方差分析，p ＜0.05 為差異顯著。響應面實驗設計與統(tǒng)計分析利用軟件Design expert 7.1(Stat-ease Inc.，MN，USA)完成。

2 結果與分析

2.1 液固比對果膠得率的影響

液固比對果膠得率的影響如圖1 所示。在液固比25mL/g 時，得率最高。在提取的過程中，物料粉末在水中的溶脹特性、以及酸解后果膠的粘度對液固分離的影響直接影響果膠的得率，并體現(xiàn)為液固比的作用。液固比太低，液固分離過程造成的損失加大，但過高液固比也未能增加果膠的得率，反而會增加醇沉工序中醇的用量，甚至有可能由于其他水溶或酸溶性成分進入提取液中相對濃度的增加而導致果膠提取得率的降低。鑒于上述實驗結果，選擇25mL/g 進行后續(xù)的單因素實驗。

圖1 液固比對香櫞果皮果膠得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on yield of pectin

2.2 pH 對果膠得率的影響

如圖2 所示，在測定的pH 中，pH1.8 時的果膠得率最高。果皮中的果膠多以原果膠的形式存在，原果膠在稀酸溶液中水解為水溶性果膠，從而使果膠從果皮轉到水相。果膠的酸離解常數(shù)變化范圍為3.55～4.10［15］，D-半乳糖醛酸的酸離解常數(shù)為3.52。本實驗在液固比25mL/g 的情況下，香櫞皮粉水溶液的初始pH 為3.26，因此選擇低于3.0 的pH 進行研究。溶液pH 偏高，提取時間將會延長，果膠的穩(wěn)定性下降，容易分解成果膠酸，使產(chǎn)率下降。而pH 過低，提取時間縮短，造成果膠進一步分解，導致果膠損失，使產(chǎn)品得率降低，同時也使果膠色澤加深［16］。pH2.0 左右作為果膠提取的最佳pH 在其他柑橘類果膠提取中也多有報道［17-18］，因此選擇在pH1.8 條件下，考察溫度與時間因素對得率的影響。

圖2 pH 對果膠得率的影響Fig.2 Effect of pH on the yield of pectin

2.3 萃取溫度和時間對果膠得率的影響

由圖3 可知，在不同溫度下，果膠的得率出現(xiàn)了不同的變化趨勢。在較高溫度95、85 和75℃下，最高值分別出現(xiàn)在0.5、1.5 和2.0h，隨著提取時間的進一步延長，果膠得率下降。而在較為溫和的65℃條件下，果膠得率整體偏低，最高值出現(xiàn)在1.5h。較高溫度下萃取時間過長，可能使果膠發(fā)生β-鍵消除作用而解聚，從而影響果膠的產(chǎn)量［19-20］。

圖3 溫度對果膠得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of pectin

2.4 響應面實驗

按照實驗設計方案進行實驗，結果見表2。

表2 響應面實驗設計條件及結果表Table 2 Design and results of response surface experiment

對表2 在不同條件下所獲得的果膠得率，利用design expert 7.1 統(tǒng)計軟件進行二項式回歸擬合，得到回歸方程:

由表3 對方程進行F 檢驗可得出，失擬檢驗得到p =0.0870，檢驗不顯著，說明其它因素對實驗結果干擾很小;擬合模型的p ＜0.0001，檢驗極顯著，說明方程與實際情況擬合良好，能夠反映果膠得率與液固比、萃取pH、萃取溫度、萃取時間之間的關系，同時復相關系數(shù)R2=0.9881，可以利用此模型對實驗中果膠率進行分析和預測。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis results of regression equation

回歸系數(shù)取值及方差分析結果見表4。

表4 回歸系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Test of significance for regression coefficient

由表4 顯著性檢驗可知，x1、x2、x3、x1x3、x3x4、x12、x22、x32、x42項對得率有顯著影響，設定的四個因素中液固比、pH、溫度對得率的影響均達極顯著水平，雖然時間對得率影響不顯著，但是時間與溫度的交互作用達到顯著水平。通過對回歸方程進行中心標準化處理，從回歸系數(shù)絕對值的大小來分析各個因素的改變對萃取率影響的大小。回歸方程一次項的回歸系數(shù)絕對值大小依次為x2＞x3＞x1＞x4，表明pH 對果膠得率的影響最大，其次萃取溫度、液固比和萃取時間。

2.3 果膠得率響應面分析

將二項式方程中的液料比、pH、提取溫度和提取時間分別固定在零水平，做出交互效應響應面圖，根據(jù)曲面變化可對各因素的作用特點獲得直觀的解釋［21］。如圖4 所示，在pH 與液固比、時間及溫度的響應曲面中可以發(fā)現(xiàn)當其他兩個因素維持不變時，果膠得率均表現(xiàn)出隨pH 升高先升高后下降的趨勢，在pH2.0 左右出現(xiàn)最大值。在時間與pH 的響應曲面中，曲面隨時間變化相對平滑，說明果膠得率對pH 變化比對時間變化更為敏感。當pH 與時間維持不變時，隨溫度升高，料液比對果膠得率的影響減小;同樣pH 與液固比維持不變時，隨溫度升高，時間對果膠得率的影響減小，說明溫度與液固比、溫度與時間因素間存在顯著的交互作用，這可能是由于較低液固比時果膠溶液的粘度較大，影響了分離效果，而較高溫度減弱了液固比造成的影響;另一方面在較高溫度下果膠的水解速度加快，也構成了溫度與時間顯著的交互作用。

圖4 各因素對果膠得率影響的響應曲面圖Fig.4 Response surface and contour plot of the factors

2.4 驗證實驗及最佳萃取條件的確定

根據(jù)模型，利用Design expert 7.1 軟件計算得到最優(yōu)工藝方案:液固比26.29mL/g，pH1.95，反應溫度82.11℃，反應時間1.85h，得率為15.41%。為方便實際操作，將優(yōu)化參數(shù)調整為液固比25mL/g，pH2.0，反應溫度85.0℃，反應時間1.75h，在此優(yōu)化條件重復實驗5 次，實際測得的平均得率為15.37%～15.68%，平均值為15.52%，與理論預測值相比，其誤差低于1.0%，說明基于響應曲面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)具有一定的實際指導意義。

3 結論

本研究以果膠得率為指標，采用響應面分析方法中的Box-Behnken 實驗設計，得到料液比、萃取溫度(℃)、萃取pH、萃取時間(h)四個因素的二項式回歸模型，經(jīng)過方差分析顯示該模型較好地反映了各因素果膠得率的影響，并得到最適工藝條件為液固比25mL/g，pH2.0，反應溫度85.0℃，反應時間1.75h，此條件下果膠的得率為15.52%。

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