響應面法優化內部沸騰法提取三七多糖

溫擁軍，蔣瓊鳳，郭 浪

(1.湖南化工職業技術學院，湖南株洲412004;2.湖南科技學院，湖南永州425100)

三七(Radix Notoginseng)又稱田七，為五加科人參屬多年生草本植物，是一種名貴的中藥材，具有止血化瘀、消腫止痛等功效［1］。三七中主要含皂苷、多糖、黃酮類化合物、揮發油等成分。研究表明［2-6］，三七多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化和延緩衰老等多種功效。目前，多糖的提取方法主要有水提法、醇提法、酸堿提法、酶提法、微波輔助法等，前三種提取方法耗時長、雜質多，酶提法成本高，而微波輔助則設備昂貴，影響了其在工業生產中的應用。韋藤幼等報道［7］提出了采用內部沸騰提取植物有效成分的方法，即先用少量低沸點溶劑(如乙醇)充分潤濕被提物料，然后迅速加入超過溶劑沸點溫度的提取液，使滲透到物料內部的低沸點溶劑發生汽化，產生內部沸騰，形成對流，從而強化提取過程，提高提取效果。響應曲面法是一種實驗優化設計方法，與正交等傳統實驗設計方法相比，它具有高效經濟、精準度高、能研究多因素間交互作用等優點［8］，已被廣泛應用到生物工程、食品工程、化學工程等領域［9］。本實驗采用響應面法優化內部沸騰法提取三七多糖工藝條件，旨在為進一步開發和利用三七這一名貴藥用植物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三七 購于株洲市藥材市場;葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、鎢酸鈉、酒石酸鉀鈉、NaOH、結晶酚、亞硫酸鈉、乙醇等 均為分析純。

DHG-9140A 型干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;HH.SYH-Ni2-C 水浴鍋 北京長源實驗設備廠;SB-5200 超聲波清洗器 上海新芝生物技術研究所;LDZ4-0.8A 離心機 北京醫用離心機廠;UV-9100紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司;FW-200 型高速萬能粉碎機 北京中興偉業儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 三七干粉的制備 將三七洗凈后，置于80℃烘箱中烘干后粉碎，過80 目篩，制成三七干粉，備用。

1.2.2 內部沸騰法提取三七多糖 稱取1g 三七干粉加入適量的60%的乙醇，置于功率為200W 的超聲波清洗器中，保持15min，使乙醇充分潤濕物料。迅速加入一定量的高溫熱水，并置于與熱水相同溫度的水浴中提取一定時間后，抽濾，取一定量的濾液離心，取上清液測多糖含量。

1.2.3 三七多糖測定方法 采用文獻［10］中的DNS法測定。取葡萄糖于105℃干燥至恒重，準確稱取100mg，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100mL，配成1.0mg/mL 的葡萄糖標準溶液。取7 支試管，分別加入葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，加蒸餾水補充至每管總體積為2mL，然后各加入1.5mL DNS 試劑，混勻并置于沸水中加熱5min，取出后立即用冷水冷卻到室溫，再向每管加入21.5mL 蒸餾水，搖勻，測A540nm。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標，A540nm為縱坐標，繪制標準曲線。取1g 三七干粉，按1∶20(g/mL)加入60%乙醇，置于超聲波清洗器中，在溫度為60℃條件下提取30min，小心倒出上清液，重新添加60%乙醇，重復提取4 次，合并所有提取液，置于4000r/min 離心機中離心10min，取上清液適當稀釋，按DNS 法測540nm 處吸光值(A)。以吸光值對應的多糖量乘以稀釋倍數，除以樣品的質量，即得到三七總多糖。各實驗條件下提取的多糖量按如下公式計算:

式中:c 為被測液A 值所對應標準曲線中葡萄糖濃度(mg/mL);D 為稀釋倍數;V 為樣品液總體積(mL);m 為投加的三七干粉質量(g)，0.9 為葡萄糖與多糖的換算系數。

1.2.4 相對提取率的計算 Y(%)=［m提/m總］×100，式中:Y 為三七多糖相對提取率，m提為某次提次的三七多糖量;m總為按實驗方法測得的三七多糖總量。

1.2.5 三七多糖提取條件優化方法 單因素實驗主要考察提取溫度，料液比，提取時間3 個因素，提取溫度選取75、80、85、90、95、100℃5 個水平，料液比選取1∶16、1∶18、1∶20、1∶22、1∶24(g/mL)5 個水平，提取時間選取4、5、6、7、8min 5 個水平，按1.2.2 實驗方法進行研究，確定各因素最佳水平;在此基礎上，采用Box-Behnken 實驗設計進一步優化，確定內部沸騰法提取三七多糖的最佳條件。

1.3 數據分析 采用Minitab15.0 軟件對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線及總多糖含量測定結果

葡萄糖標準曲線如圖1 所示，由圖可知，在0～1.2mg/mL范圍內，葡萄糖濃度與吸光值A 呈線性關系。按實驗方法測得三七總多糖含量為85.8mg/g。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 單因素實驗結果與分析

2.2.1 提取溫度對三七多糖相對提取率的影響 提取溫度對三七多糖相對提取率的影響見圖2。由圖2可知，當溫度低于85℃時，相對提取率隨溫度的升高而增加，超過85℃則下降。這是因為60%乙醇在常壓下的沸點為81℃左右［11］，當溫度低于此，物料內部乙醇未產生沸騰，5min 內提取不完全，故提取效果差;但當溫度過高時，乙醇沸騰過快，有效提取時間減少，且三七具有溶脹性，溫度過高容易造成大分子通道阻斷，進而影響提取率［12］，故最佳提取溫度為85℃。

圖2 提取溫度對三七多糖提取的影響Fig.2 Effect of temperature on RNP extraction

2.2.2 料液比對三七多糖相對提取率的影響 料液比對三七多糖相對提取率的影響結果見圖3。圖3結果表明，三七多糖的相對提取率隨料液比的減少而增加，當料液比為1 ∶20 時，相對提取率達到84.46%，繼續降低料液比提取率趨于穩定。而低料液比會造成提取劑的浪費和后續濃縮的困難。故最適料液比為1∶20。

2.2.3 提取時間對三七多糖相對提取率的影響 提取時間對三七多糖相對提取率的影響結果如圖4 所示。由圖4 可知，采用內部沸騰法提取速度很快，5min 內基本能完成多糖的提取，相對于超聲輔助等提取方法，該法能大大縮短提取時間，具有明顯的優勢。因此，提取時間選擇為5min。

2.3 響應面優化實驗結果與分析

通過單因素實驗，確定了提取溫度(X1)、料液比(X2)、提取時間(X3)的最佳水平，以各因素的最佳水平為中心(X =0)，運用Box-Behnken 實驗設計對提取條件進一步優化，利用Minitab15.0 軟件設計一個3因素3 水平共15 個實驗點的實驗設計，其中中心點重復3 次，用來計算實驗誤差，所得結果如表1 所示。

圖3 料液比對三七多糖提取的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on RNP extraction

圖4 提取時間對三七多糖提取的影響Fig.4 Effect of time on RNP extraction

表1 Box-Behnken 實驗設計及結果Table 1 Box-Behnken design and experimental results

以三七多糖相對提取率為響應值，以提取溫度(X1)、料液比(X2)、提取時間(X3)為自變量，用Minitab15.0 軟件對表1 所得數據進行多元回歸分析，得到結果見表2、表3。結果表明，模型在α =0.05 水平上回歸顯著;失擬項p ＞0.1，失擬不顯著;其中，X1、X2、平方項以及X1X2項對三七多糖相對提取率有顯著影響，X3、X1X3項不顯著。得到回歸方程:三七多糖相對提取率Y(%)= 84.58 + 0.56X1+1.06X2- 0.83X12- 2.86X22- 1.44X32+ 1.76X1X2+0.57X2X3。決定系數R2為97.70%，說明模型擬合程度好。求解模型得到各因素最佳水平為:提取溫度X1= 89.4℃、料液比X2= 1 ∶19.1、提取時間X3=5.08min，模型預測結果為85.05%。考慮到實際操作情況，將最佳條件修約為:提取溫度X1=89℃、料液比X2=1∶19、提取時間X3=5min。在最佳條件下進行驗證，3 次實驗取平均值，結果為84.86%，說明該模型可以用來指導實際生產，有實用價值。

表2 模型的回歸分析Table 2 Regression analysis of model

根據回歸方程繪制的響應面圖見圖5～圖7，響應面可以直接反映各因子對響應值影響的大小。

圖5 Y=f(X1，X2)響應面立體分析圖Fig.5 3D analysis chart of y=f(X1，X2)

從圖5 可知，提取溫度X1與料液比X2交互作用顯著，固定提取時間X3為0 水平時，當提取溫度為88.3℃、料液比為1∶19.2 時，三七多糖相對提取率存在最大值，可達85.01%。

圖6 顯示，固定提取溫度X1為0 水平時，料液比X2與提取時間X3交互作用較顯著，當料液比為1∶19.6時，提取時間在4～5.17min 范圍內，三七多糖相對提取率呈明顯上升趨勢，在5.17～6min 內呈下降趨勢。當提取時間為5.17min，料液比對響應值的影響呈先升后降趨勢，在1 ∶19.6 時達到極大值，為84.69%。

圖7 顯示，固定料液比X2為0 水平時，提取溫度X1與提取時間X3交互作用不顯著，固定提取溫度不變時，提取時間在4～6min 范圍內，三七多糖相對提取率呈先升后降之勢。而當固定提取時間時，提取溫度在85～86.8℃內，三七多糖相對提取率上升并達到最大值，為84.67%。

表3 模型的方差分析Table 3 Variance analysis of model

圖6 Y=f(X2，X3)響應面立體分析圖Fig.6 3D analysis chart and y=f(X2，X3)

圖7 Y=f(X1，X3)響應面立體分析圖Fig.7 3D analysis chart of y=f(X1，X3)

3 結論

本文采用單因素結合響應曲面法對內部沸騰法提取三七多糖的條件進行了研究。選取了提取溫度，料液比，提取時間進行單因素實驗，確定了各因素最佳水平，在此基礎上，運用Box-Behnken 實驗設計對提取條件進一步優化，建立了關鍵影響三七多糖提取率的二次多項式，得到最佳提取條件為:提取溫度X1= 89℃、料液比X2= 1 ∶19、提取時間X3=5min，在此條件下，三七多糖相對提取率可達84.86%。

內部沸騰法應用于提取植物有效成分，具有速度快，提取率高的特點［13］。在本實驗中，對三七前處理階段采用超聲輔助，使三七干粉與乙醇在更短的時間內充分潤濕和滲入，進一步節約了提取時間，提高提取效果，本實驗中三七多糖提取過程僅20min即可完成，并能達到較高的提取效果。因此，該法是一種安全、高效、簡便的植物有效成分提取方法。

［1］鄭光植，楊崇仁.三七生物學及其應用［M］.北京:科學出版社，1994.

［2］Zhang C G，Huang Q Q. Effect of Panax notoginseng polysaccharide on cellular immune function of rats traumatized［J］.Chin JTrauma，2005，21(9):771-772.

［3］陳為，張友成，周苗苗，等.三七多糖對微波輻射大鼠血清氧化指標的影響研究［J］.中國輻射衛生，2009(2):184-185.

［4］蔡瑛，楊柳，思永玉，等.腸內營養加三七多糖對創傷大鼠白介素-2 水平的影響［J］.昆明醫學院學報，2011，(6):27-28.

［5］Gao H，Wang F，Lien E J，et al.Immunostimulating polysaccharides from Panax notoginseng［J］. Pharmaceutical Research，1996，13(8):1196-2000.

［6］Ohtani K，Mizutani S，Hatono S，et al. Sanchinan- A，a reticuloendothelial system activating arabinogalactan from sanchiginseng(roots of Panax notoginseng)［J］.Planta Medica，1987，53(2):166-169.

［7］韋藤幼，趙鐘興，郝瑞然，等.內部沸騰強化肉桂皮中肉桂醛的提取工藝及機理［J］.林產化學與工業，2006，26(3):63-65.

［8］楊文雄，高彥祥.響應面法及其在食品工業中的應用［J］.中國食品添加劑，2005(2):68-71.

［9］張永康，姚祖鳳，歐陽輝，等.超臨界CO2從獼猴桃果仁中萃取亞麻酸油的工藝研究［A］.第四屆全國超臨界流體技術學術及應用研討會論文集［C］.貴陽:中國化學化工學會化學工程專業委員會超臨界流體技術專業學組，2002:211-213.

［10］游玟娟，溫擁軍.北五味子多糖提取條件及其抗氧化性能［J］.食品與發酵工業，2012，38(9):206-210.

［11］李俊新，孫寶，郭子成，等.二元液系氣-液平衡相圖實驗體系的綠色選擇［J］.實驗室科學，2011，14(3):70-74.

［12］翁艷英，韋藤幼，童張法.內部沸騰法提取三七多糖的研究［J］.時珍國醫國藥，2011，22(6):1435-1436.

［13］陳曉光，韋藤幼，彭夢微，等.內部沸騰法提取香菇多糖的工藝優化［J］.食品科學，2011，32(10):31-34.