HPLC 法測定不同品種蘑菇中麥角硫因的含量

張 翠，趙艷敏，白淑芳，劉岱琳，*

(1.中國人民武裝警察部隊后勤學院生藥教研室，天津市職業與環境危害防治重點實驗室，天津300162;2.天津中醫藥大學，天津300193)

麥角硫因(巰基組氨酸三甲基內鹽，ergothioneine，EGT)是1909 年在麥角中發現的一種稀有化合物［1］。它是機體內的重要活性物質，但不能由動物機體自身合成，只能從食物中攝取。麥角硫因具有清除自由基、維持DNA 的生物合成、細胞的正常生長及細胞免疫等多種生理功能［2-6］，可用于開發戶外護膚產品，防護性的化妝品［7-8］以及眼科產品，谷胱甘肽理想的替代品等［9］，已漸漸得到更多人的關注。目前麥角硫因的獲得方式主要有化學合成和天然來源的分離［10-12］。但是化學合成的麥角硫因由于存在副產物等其他雜質而束縛了其在食品、藥品與保健品領域中的應用。上世紀90 年代日本學者從日本側耳(Ampteramyces japonicus)的子實體中分離得到麥角硫因［13］。這是首次從蘑菇中分離到該化合物。后續很多學者開始著力研究麥角硫因的分離研究［14-16］。麥角硫因的國外研究報道較多，而國內還處于探索階段。我國的真菌資源比較豐富，目前測定麥角硫因含量的研究很少，國外曾報道過利用C18色譜柱對杏鮑菇及靈芝中的麥角硫因進行測定［17-18］，國內也有學者采用C18 色譜柱測定了雙孢菇中麥角硫因的含量［19］。麥角硫因是一種稀有氨基酸，而如今對氨基酸的測定多采用氨基色譜柱，國內有人利用氨基色譜柱測定了紅棗、苜蓿芽等食品中多種氨基酸的含量［20-21］。我們在文獻調研的基礎上結合麥角硫因的性質，首次建立了用氨基色譜柱測定麥角硫因的HPLC 檢測方法，對產自天津、山東、東北三省地區的10 種蘑菇中麥角硫因的含量進行測定，麥角硫因的資源調查和蘑菇的進一步合理開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10 種蘑菇樣品分別為產自天津的平菇(Pleurotus ostreatus(Fr.)Kummer)、雞腿菇(Copyinds comatus (MUII. Fr)Gray)、金針菇(Flammulina velutiper(Fr.)Sing)、海鮮菇(Hypsizygus marmoreus(Peck)H.E.Bigelow)、口蘑(Tricholomagambosum)，產自山東的白玉菇(Hypsizygus marmoreus(pk)Sing)，(以上均為鮮蘑菇)產自吉林省長白山地區的松蘑(Suillusluteus (L.exFr.) GrayBoletusluteu )、榛蘑(Armillaria mellea (Vahl ex Fr.)Quel)、猴頭菇(Hericium erinaceus)和遼寧省鐵嶺地區的白蘑(Tricholoma mongolicum Imai)。(以上均為干蘑菇);麥角硫因標準品，含量98% 天津市科曼思特醫藥科技發展有限公司;乙腈為色譜級;純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司;其他試劑均為分析純。

高效液相色譜儀(泵型號LC-20AT、檢測器SPDM20A) 日本Shimadzu 公司;MT5 電子天平瑞士梅特勒-托利多公司;HH-2 數字顯示恒溫水浴鍋 常州市國華儀器有限公司;KQ5200E 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;DHG-9000A 型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海益恒實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制與曲線繪制 精密稱取麥角硫因對照品適量，置于10mL 棕色容量瓶中，用色譜甲醇定容，搖勻，即得麥角硫因對照品溶液(0.1060mg/mL)。分別取上述對照品溶液0.5、2.5、5.0、7.5、10.0mL，置于10mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容后進行HPLC 測定。

1.2.2 待測樣品前處理 稱取不同品種干蘑菇各2.5g、鮮蘑菇各8.0g 于100mL 容量瓶中，加入80mL去離子水，于100℃水浴鍋中加熱回流提取1h，冷卻至室溫，用去離子水定容，搖勻，用0.45μm 微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液，于冰箱中冷藏保存。

1.2.3 樣品水分含量測定［22］取粉碎成0.5cm ×0.5cm 的蘑菇樣品各2g，平鋪于干燥恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，打開瓶蓋在100～105℃干燥5h。將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30min，精密稱定，再在上述溫度干燥1h，冷卻稱重，至連續兩次稱重的差異不超過5mg 為止。根據減失的重量，計算樣品中的水分含量(%)，平行三次，求平均值。

1.2.4 色譜條件 色譜柱:Kromasil 100-5NH2柱(250mm ×4.60mm，5μm);流動相:乙腈-5mmol/L 醋酸銨(80∶20);流速:1.0mL/min;檢測波長:254nm;柱溫:30℃;進樣量:20μL。

1.2.5 樣品含量測定 各樣品按1.2.2 項下方法制備，平行三次實驗，測定各供試品峰面積，代入標準曲線，計算供試品中麥角硫因的濃度C(mg/mL)，利用計算公式計算各樣品的含量。將各樣品質量M(mg)和水分含量W(%)代入如下公式，計算得到各樣品的麥角硫因含量。

式中:C:供試品中麥角硫因的濃度(mg/mL);V=100mL;M:各樣品的質量(mg);W:各樣品的水分含量(%)

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

本研究發現，麥角硫因在254nm 處有最大吸收，實驗中流動相考察了不同比例乙腈-5mmol/L 醋酸銨(85∶15)，乙腈-5mmol/L 醋酸銨(80∶20)，乙腈-5mmol/L 醋酸銨(90∶10)等，結果發現流動相為乙腈-5mmol/L 醋酸銨(80∶20)時，麥角硫因與樣品中其他雜質能達到良好的分離效果，麥角硫因的保留時間為12.7min，標準圖譜見圖1(A)。按照色譜峰的保留時間定性，外標法峰面積定量，口蘑樣品的圖譜見圖1(B)。

圖1 麥角硫因對照品(A)及口蘑樣品(B)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of ergothioneine standard and sample

2.2 麥角硫因標準曲線

在規定色譜條件下，將標準品系列溶液進樣20μL 進行測定，以峰面積Y 對麥角硫因的質量濃度X(mg/mL)進行線性回歸。結果顯示麥角硫因在0.005～0.106mg/mL 范圍內與峰面積相關性較好，回歸方程為:Y =4.69 ×107X-67186，R2=0.9999。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度實驗 取對照品溶液連續進樣5 次，測得平均峰面積為5037662，RSD =0.18%，表明儀器精密度良好。結果見表1。

2.3.2 穩定性實驗 取處理后的白蘑樣品分別于0、2、4、6、8、12h 各進樣一次，測得平均峰面積為528038，RSD =1.01%，表明在12h 內供試品溶液穩定性良好。結果見表2。

2.3.3 重復性實驗 精密稱取白蘑柄樣品5 份，每份2.5g，按1.2.2 項下方法制備，依方法進行測定，計算出該樣品麥角硫因的平均含量為0.055%，RSD =0.90%，表明該方法重復性良好。結果見表3。

2.3.4 加樣回收率實驗 取已知麥角硫因含量的白蘑柄樣品2.5g，分別加入相當于樣品中麥角硫因含量的80%、100%、120%的對照品溶液，按1.2.2 項下方法進行處理，供試品溶液進行HPLC 測定。結果顯示回收率良好，如表4。

表1 精密度考察結果Table 1 The result of precision tests

表2 穩定性考察結果Table 2 The result of stability tests

表3 重復性考察結果Table 3 The result of repeatability tests

表4 麥角硫因加樣回收率結果Table 4 The addition recovery of ergothioneine

表5 多種蘑菇中水分含量的測定(n=3)Table 5 The moisture contents of different mushrooms(n=3)

表6 不同品種及不同部位蘑菇中麥角硫因的含量測定(n=3)Table 6 The contents of ergothioneine in different kinds of mushrooms(n=3)(1)

2.4 樣品水分含量測定

按1.2.3 項下測得各樣品的水分含量W(%)，結果如表5。

2.5 樣品含量測定

按1.2.5 項下測得各樣品的麥角硫因含量，結果如表6。

本實驗選取了東北地區，天津和山東地區常見蘑菇為原料，并將幾種可以明確分辨傘和柄的蘑菇進行分離，分為傘和柄兩種部位進行麥角硫因的含量測定，結果發現，不同品種的蘑菇中麥角硫因含量差異較大，只有東北的松蘑中不含有麥角硫因，其余九種蘑菇中均不同程度含有麥角硫因。我們也對能夠明確辨識的蘑菇傘和柄分別測定麥角硫因的含量，結果顯示同種蘑菇的不同部位中麥角硫因含量也存在差異，尤其白蘑的蘑菇傘中不含有麥角硫因而蘑菇柄中卻含有。這可能與麥角硫因在真菌體內合成過程有關，還有待進一步研究。

同時，因各蘑菇樣品的水分含量不同，尤其是新鮮的蘑菇中含有大量的水分，在室溫下儲藏時質量極其不穩定，所以1.2.2 項下稱取的蘑菇質量并不能代表其真實質量，所以我們通過測定各樣品的水分含量，將各樣品的質量折算成不含水分的蘑菇質量，保證了含量測定的真實性、準確性。

3 結論

本實驗利用高效液相色譜法建立了麥角硫因的含量測定方法，該方法簡便、快速、靈敏。實驗中選自天津、山東及東北地區的10 種蘑菇材料，測得其中麥角硫因的含量，含量范圍在0.000%～0.280%之間。麥角硫因含量由高到低依次為:榛蘑傘＞金針菇＞口蘑＞雞腿菇傘＞海鮮菇＞白玉菇柄＞雞腿菇柄＞白蘑柄＞猴頭菇＞平菇＞榛蘑柄＞松蘑、白蘑傘。實驗結果為蘑菇的開發利用提供了科學依據。

此外對于含有麥角硫因的蘑菇也可以進一步馴化蘑菇菌種，優化培育條件，可以提高麥角硫因的含量，為其綜合開發利用奠定基礎。這些仍需要我們科研工作者進行深入研究和探討。

［1］Tanret C.Sur une base nouvelle retiree du seigle ergote，L-Ergothioneine Compt［J］.Rend Acad Sci，1909，149:222-224.

［2］Hartman P E.Ergothioneine as antioxidant［J］.Methods Enzymol，1990，186:310-318.

［3］Aruoma O I，Spencer J P，Mabmood N.Protection against oxidative damage and cell death by the natural antioxidant ergothioneine ［J］.Food Chem Toxicol，1999，37 (11 ):1043-1053.

［4］Aruoma O I，Whiteman M，England T G，et al.Antioxidant action of ergothionein:Assessment of its ability to scavenge peroxynitrite［J］.Biochem Biophys Res Commun，1997，231(2):389-391.

［5］朱本占，毛莉，范瑞梅，等.天然抗氧化劑麥角硫因保護銅所致DNA 和蛋白質氧化損傷的作用機理［J］.科技通報，2011，56(27):2283-2288.

［6］喬風云，陳欣，余柳青.抗氧化因子與天然抗氧化劑研究綜述［J］.科技通報，2006，22(3):332-336.

［7］林陳水，付水星，黎小軍，等.一種稀有的天然氨基酸—麥角硫因［J］.氨基酸和生物資源，2006，28(1):63-67.

［8］D l 比賽特.使用包含麥角硫因的個人護理組合物調節哺乳動物的角質組織:中國，200680016867.X［P］.2008-05-07.

［9］李軼群，周念波.麥角硫因的生物學功能及其應用［J］.食品工程，2010，3:26-28.

［10］Xu J，Yadan J C.Synthesis of L-(+)-ergothioneine［J］.Org.Chem，1995，60(20):6296-6301.

［11］Yadan J C，Xu J.Process for the preparation of ergothioneine［P］.US patent:5，438，151.August 1，1995.

［12］周念波，李軼群，殷勤紅.氧化鋁柱層析從雙孢菇菇柄中提取麥角硫因［J］.安徽農業科學，2010，38(27):14842-14843.

［13］何波.日本側耳的兩種甜菜堿型氨基酸衍生物［J］.國外醫學中醫中藥分冊，1998，20(6):36-39.

［14］Newton G L，Dorian R，Fahey R C.Analysis of biological thiols-Derivatization with monobromobimane separation by reverse-phase high - performance liquid chromatography［J］.Anal Biochem，1981，114(2):383-387.

［15］Carlsson J，Kierstan M P，Brocklehurst K.A convenient spectrophotometric assay for the determ ination of L-ergothioneine in blood［J］.Biochem J，1974，139(1):237-242.

［16］Elizabeth W.Estimation of ergothioneine in urine by paperpartition chromatography［J］.The Lancet，1949，253(6555):652-654.

［17］Estrada A E，Lee H，Beelman R B，et al.Enhancement of the antioxidants ergothioneine and selenium in Pleurotus eryngii var.eryngii basidiomata through cultural practices［J］.World J Microbiol Biotechnol，2009，25:1597-1607.

［18］Lee W Y，Park E J，Ahn J K.Supplementation of Methionine Enhanced the Ergothioneine Accumulation in the Ganoderma neo-japonicum Mycelia［J］.Appl Biochem Biotechnol，2009，158:213-221.

［19］周念波，朱艷琴，殷勤紅.高效液相色譜法測定雙孢菇中麥角硫因的含量［J］.食品科技，2010，35(10):271-272，279.

［20］張艷紅，陳兆慧，王德萍，等.紅棗中氨基酸和礦質元素含量的測定［J］.食品科學，2008，29(1):263-266.

［21］祝美云，王艷萍，王成章，等.用HPLC 法測定富鐵鋅苜蓿芽氨基酸的含量［J］.食品科學，2007，28(8):438-441.

［22］國家藥典委員會.中國藥典(一部)［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄52.