臍橙新型殼聚糖水凝膠抑菌保鮮研究

李瑤瑤，李喜宏，* ，鄧玉璞，劉丹舟，李 琪

(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457;2.北京林業大學，北京100083)

臍橙含有豐富的維生素、黃酮類化合物等防癌物質，是優良的營養保健綠色食品，是鮮食品種中的“柑桔之王”［1］。但是在貯藏期間，臍橙極易被青霉菌所感染［2-3］而造成腐爛，嚴重影響果實品質和商品價值，大大降低了臍橙的利用率，制約了我國臍橙鮮果供應及果汁加工產業的發展。目前，雖然可以采用化學方法對青霉菌引起的病害進行有效控制，但果實的食用安全性卻倍受爭議［4］。水凝膠是一類具有三維網絡結構的高分子聚合物，由親水性的高分子化合物交聯而成，能在水中溶脹并保持原有結構而不被溶解［5］。殼聚糖(chitosan，簡稱CTS)，又稱幾丁聚糖，其化學結構與纖維素類似，廣泛存在于真菌的細胞壁及蝦、蟹等甲殼類動物的外殼中［6］。由于原料來源廣泛，廉價易得，且具有良好的生物相容性、安全性和生物降解性，被廣泛應用于果蔬的貯藏保鮮領域。然而，純殼聚糖凝膠性質很不穩定，隨介質變化而變化。聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，簡稱PVA)溶于水，且具有高度的生物相容性，其粘連機制也被Paradossi 等人［7］所證實。殼聚糖水凝膠綜合了殼聚糖和聚乙烯醇二者的優點［8］，作為吸附蛋白質的藥物［9］及軟骨組織工程支架材料［10］被廣泛應用。目前，殼聚糖及水凝膠被廣泛應用于果蔬貯藏保鮮領域，然而，有關二者的混合體殼聚糖水凝膠在該領域的報道卻很罕見。本研究通過分析比較不同濃度的殼聚糖水凝膠對臍橙采后青霉菌的抑制作用，得出最佳抑制濃度，以期在達到臍橙保鮮效果、延長貨架期的同時為臍橙采后生理及貯藏技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試臍橙 采摘于云南省建水縣，由紅河州和源農業開發有限公司提供。2012 年11 月25 日運抵天津科技大學農產品保鮮實驗室。果實呈橢圓形，果皮淺黃色，色澤均勻，果面光滑。挑選七八成熟、大小均勻、無病蟲害且無機械損傷的果實進行實驗;殼聚糖(脫乙酰度≥85%) 濟南海得貝細胞生物工程有限公司;PVA(聚合度:1750 ±50) 天津元麗化學試劑有限公司;50%戊二醛 青島正浩化學試劑股份有限公司。

電子天平奧豪斯儀器(上海)有限公司;C21-SN216多功能電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司;HHS-6S 電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠;WH7401-50B 型電動攪拌器 天津市威華儀器設備有限公司;WH-3 微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;TEZ-PS-100W熒光倒置顯微鏡 北京中翰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 PDA 培養基:去皮馬鈴薯300g，切成小塊加水煮沸30min，雙層紗布過濾，濾液加葡萄糖20g，瓊脂20g，定容至1000mL，121℃滅菌20min。

殼聚糖水凝膠的制備:殼聚糖水凝膠的制備參考楊旭東等的方法［11］并加以修改，將殼聚糖經2%醋酸溶解配制成1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%溶液，過濾掉不溶雜質;將PVA 在80～85℃溶解成5%溶液;電動攪拌并加熱至40 ～50℃，使100mL 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%殼聚糖和5mL 5%PVA 混合均勻，然后加入1.12mL 3% 戊二醛攪拌均勻，并在40～45℃靜置交聯，室溫下靜置24h 成膜。

1.2.2 菌種分離、純化與鑒定及回接 參考楊韋杰等的方法［12］并加以修改，選擇具有典型發病癥狀的臍橙，根據病健交界處分離原則，以75%酒精清洗患處，用無菌刀片切取病健交界處5mm ×5mm2的組織，于超凈臺轉入PDA 平板培養基上，于28℃恒溫恒濕培養箱中倒置培養。當培養出的菌落直徑生長至1cm 時，用滅菌后的接種針挑取前緣菌絲植入另一培養基內培養，重復上述操作3 次即可獲得純化菌株。將純化菌株回接到果實，按照柯赫氏法則(Koch’s postulates)，通過肉眼觀察致病菌菌落特征和培養特征，包括菌落大小、顏色、質地、邊緣、滲出物等，顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗形態特征，參照植物病原真菌學［13］、普通真菌學［14］及真菌鑒定手冊［15］進行病原菌的鑒定。按上述方法將青霉菌分離出來，繼續培養后，取健康臍橙表皮，采用針刺法，在超凈工作臺內用滅菌針刺傷表皮0.5 ～1.0cm2，待PDA 培養基上長滿菌絲后，用無菌打孔器打下菌塊，使菌絲面貼在刺傷處，然后將其放入底層有吸水紙、中間有載玻片的滅菌培養皿中，加適量無菌水，28℃恒溫培養。待觀察出現癥狀后再按原方法分離、純化返接后的病原菌，觀察是否與原致病菌一致。

1.2.3 離體抑菌實驗 參考劉鋒等［16］方法并加以修改，取1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的殼聚糖水凝膠溶液1mL 分別加入9mL 加熱融化后約50℃的PDA 培養基中，混勻后倒入培養皿中制成含體積分數為10%的殼聚糖水凝膠平板，以等量未加入殼聚糖的水凝膠作為對照。將長勢均勻的病原菌沿菌落邊緣用直徑為5mm 的打孔器打大小相同的菌塊，分別接種于上述培養基中，每皿放置1 塊，將培養皿置28℃恒溫恒濕培養箱中培養。每個處理重復三次。每天觀察記錄(共5d)，并用十字交叉法測量各皿中菌落直徑，計算抑菌率。參照張悅等的方法［17］計算抑菌率。

1.2.4 牛津杯法抑菌實驗 參照劉冬梅等的方法［18］并加以調整，將受試菌體分別接種于含有馬鈴薯葡萄糖液體培養基的試管中，每個受試菌種接種3 支。100r/min 震蕩搖床中37℃恒溫活化24h，得到一定濃度的菌液。將活化后的菌種先用無菌水洗下菌苔，用血球計數板計數孢子濃度，制成2.4 ×106 個/L孢子懸浮液，備用。于無菌操作條件下，在平皿中心放置滅菌過的直徑為8mm 的牛津杯，用無菌移液槍吸取0.5mL 菌懸液置于平皿中涂布均勻，再倒入10mL PDA 培養基，待培養基凝固后，用無菌移液槍分別移取50μL 含量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的殼聚糖水凝膠抑菌液置于牛津杯中，注意不要將菌懸液溢出牛津杯外。以無菌水為對照，將制好的平板置于恒溫恒濕培養箱中28℃下培養5d 后用十字交叉法測量抑菌部分直徑大小。每個處理重復三次。抑菌圈計算公式:

1.2.5 涂膜實驗 參照胡云峰等的方法［19］并加以調整，將濃度為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的殼聚糖水凝膠均勻涂于健康臍橙表皮，置于(4 ±0.1)℃的溫度梯度箱中貯藏，相對濕度為85%～90%，每個處理15kg，90d 后觀察臍橙外觀品質并測定失重率、還原糖、可溶性固形物等指標。

可溶性固形物(SSC)含量:用ATAGO 袖珍數字式白利度折光儀(Digital Pocket Brix Refractometer(cat.No.3840 PAL-α))測定，重復5 次，取平均值;可滴定酸(TA)含量:用酸堿滴定法測定，采用蘋果酸當量值表示;還原糖含量:采用3，5-二硝基水楊酸法測定;失重率:采用直接稱量法測定;好果率:采用觀察法測定(實驗以果實表皮出現水漬斑定為腐爛果)。

失重率(%)= (貯藏前的重量-貯藏后的重量)/貯藏前的重量×100

1.3 統計分析

全部實驗數據用Microsoft Excel 2007 進行統計處理，計算標準偏差(ˉX ±SE);并使用DPS7.55 數據處理系統進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 青霉菌的鑒定及回接

青霉菌菌落呈絨狀，生長較快，初期菌絲體為白色，有粘性，隨培養時間的延長，呈同心環狀青綠色霉層，邊緣白色(圖1)。在顯微鏡下觀察，營養菌絲體呈透明，分生孢子梗(圖2)和菌絲(圖3)均有橫隔，較光滑。分生孢子梗先端有1～3 個分枝，呈掃帚狀。分生孢子無色，近球形，呈念珠狀串生。對照《植物病原真菌學》、《普通真菌學》、《真菌鑒定手冊》等，初步鑒定該病原菌為子囊菌亞門(Ascomycotina)，不整囊菌綱(Plectomycetes)，散囊菌狀目(Eurotiales)，散囊菌科(Eurotiaceae)，青霉屬(Penicillium)。將菌種回接，該病原菌侵染健康臍橙表皮后，最初在菌侵部位周圍形成深褐色水漬狀，邊緣不明顯，之后長出白色菌絲，慢慢形成青色霉層，邊緣有白邊環，不整齊，水漬斑不斷擴展，最終浸染整塊表皮。將該病原菌分離、純化，也得到與回接實驗前相同的病原菌。

圖1 PDA 培養基上青霉菌菌落Fig.1 Colony of Penicillium italicum on PDA medium

圖2 青霉菌分生孢子梗和分生孢子Fig.2 Conidiophore and seminula of Penicillium italicum

圖3 青霉菌菌絲Fig.3 Hyphae of Penicillium italicum

2.2 不同濃度殼聚糖水凝膠對青霉菌菌落直徑大小的影響

菌落直徑的大小直接反映了殼聚糖水凝膠對青霉菌的抑制情況。殼聚糖水凝膠明顯抑制了青霉菌的生長。青霉菌邊緣白色菌絲變短，菌落直徑變小。由圖4 可看出，在培養的第5d，CK 菌落直徑為22mm，大于其它處理，差異顯著(p ＜0.05)。當殼聚糖水凝膠濃度由1.0%逐漸增大時，青霉菌的菌落直徑逐漸減小，當增至2.0% 時菌落直徑達到最小值15mm，然后隨其濃度的增加，菌落直徑又逐漸增大。由于殼聚糖具有生物降解性，且其代謝產物可被生物體完全吸收［20］。當殼聚糖水凝膠濃度增大時，殼聚糖降解后促進了青霉菌的生長，使菌落直徑增大。說明當殼聚糖水凝膠濃度為2.0%時，對青霉菌的抑制效果最好。

圖4 不同濃度殼聚糖水凝膠對青霉菌菌落直徑的影響Fig.4 Effect of different concentrations of chitosan hydrogel on the colony diameter of Penicillium italicum

2.3 不同濃度殼聚糖水凝膠對青霉菌抑菌率的影響

由圖5 可以看出，將接種菌餅后的培養基置于恒溫恒濕培養箱中培養1d 后，1.0%殼聚糖水凝膠抑菌率最低，僅為30%，隨濃度增大，抑菌率增大，但當濃度大于2.0%時，抑菌率不再提高。培養2d 后，從圖中可以明顯看出，1.0%殼聚糖水凝膠抑菌率最低，2.0%抑菌率最高。培養前兩天，1.5%、2.5%和3.0%這三組差異不顯著(p ＞0.05)，但隨著培養時間的增長，差異性逐漸顯著(p ＜0.05)。當殼聚糖水凝膠濃度為2.0%時抑菌率最高，但隨著培養時間的增長，抑制效果減弱。這是由于隨著時間的延長，青霉菌對生長環境逐漸適應，對殼聚糖水凝膠的抵抗力逐漸增大。

圖5 不同濃度殼聚糖水凝膠對青霉菌抑菌率的影響Fig.5 Effect of different concentrations of chitosan hydrogel on the inhibiting rate of Penicillium italicum

2.4 不同濃度殼聚糖水凝膠對青霉菌抑菌圈大小的影響

當向牛津杯中加入殼聚糖水凝膠后，一方面青霉菌開始生長，另一方面，抑菌物質就隨溶劑向培養基內呈球形擴散，離杯越近，抑菌物質濃度越大，離杯越遠，抑菌物質濃度越小。圖6 表明，CK 沒有抑菌圈，與殼聚糖水凝膠處理組呈顯著差異(p ＜0.05)。當殼聚糖水凝膠濃度為1.0% 時，抑菌圈直徑為5mm，1.5%時直徑為19mm，隨著濃度增大，抑菌圈增大，當濃度為2.0%時，抑菌圈達到最大值65mm，然后隨其濃度的增大，抑菌圈減小，且當濃度大于2.0%時，抑菌圈內部長滿青霉菌。這可能是由于當殼聚糖水凝膠濃度增大時，殼聚糖含量增加，醋酸含量相對減少，使得其pH 升高，抑菌作用降低［21］。同時，由于殼聚糖本身溶解性較差，濃度多高時導致其自身絮凝，使殼聚糖水凝膠有效抑菌物質濃度降低，達不到理想的貯藏保鮮效果。說明當殼聚糖水凝膠濃度為2.0%時，有效抑菌物質濃度最高，時效最長，抑制效果最好。

表1 殼聚糖水凝膠濃度對臍橙品質及外觀的影響Table1 Effect of chitosan hydrogel on the quality and appearance of Navel orange

圖6 不同濃度殼聚糖水凝膠對青霉菌抑菌圈大小的影響Fig.6 Effect of different concentrations of chitosan hydrogel on the inhibiting zone of Penicillium italicum

2.5 不同濃度殼聚糖水凝膠對臍橙貯藏效果的影響

由表1 可知:五種不同濃度的殼聚糖水凝膠處理的臍橙果實表面飽滿，顏色鮮亮。1.0%時果皮銹斑較多，1.5%時較少，2.5%果實出現白斑點，3.0%時白斑點增多，而濃度在2.0% 時能夠較好地保持外觀，不出現銹斑和白斑點，且失重率降低30%，好果率提高80%左右。相比之下，對照組果皮皺縮且無光澤，有銹斑。結果表明，當殼聚糖水凝膠濃度為2.0%時對臍橙的貯藏效果最好。

3 結論

以紐荷爾臍橙為試材，分離純化青霉菌，分析比較1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%殼聚糖水凝膠對臍橙采后青霉菌的抑制效果。離體抑菌實驗表明，當用殼聚糖水凝膠處理后，青霉菌的菌落直徑明顯減小，且當濃度為2.0%時，菌落直徑達到最小值，抑菌率達到最大值。牛津杯法抑菌實驗表明，殼聚糖水凝膠的濃度決定了抑菌圈的大小，當濃度為2.0%時，抑菌圈最大。涂膜實驗中，綜合失重率、好果率、可溶性固形物、可滴定酸、還原糖及臍橙外觀各項指標確定，當濃度為2.0% 時，臍橙的貯藏品質較好。通過以上實驗，可以確定當殼聚糖水凝膠濃度為2.0%時，可以較好的抑制青霉菌的生長，減少臍橙的腐爛率，進而延長其保鮮期。

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