外源酶在肉品加工中的應用研究進展

王穩航，劉 婷，趙 可，李 茜，滕安國，劉安軍

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

酶是催化特定化學反應的蛋白質、RNA或其復合體，是生物催化劑，能通過降低反應的活化能加快反應速率，但不改變反應的平衡點。根據酶催化反應的類型，國際酶學委員會把酶分為6大類：氧化還原酶類、轉移酶類、水解酶類、裂合酶類、異構酶類和連接酶類，分別用1、2、3、4、5、6來表示[1]。食品酶制劑是指動物或植物的可食或非可食部分直接提取，或由傳統或通過基因修飾的微生物(包括但不限于細菌、放線菌、真菌菌種)發酵、提取制得，用于食品加工，具有特殊催化功能的生物制品。

作為肌肉組織中的一個重要組成，酶在肌肉的正常生理活動中發揮著重要作用，如糖代謝相關酶類、磷酸激酶等，而真正在畜禽屠宰后肌肉嫩化的過程扮演了重要角色的內源酶，主要為鈣激活蛋白酶、組織蛋白酶、蛋白酶體等，以及最近發現具有蛋白水解作用的caspase-3、caspase-6等。關于內源酶在肉的成熟過程中的作用已經進行相關綜述[2-3]。

在肉品實際加工過程中，常需要額外添加一些酶類來改善和提高肉的加工工藝和感官品質，與肉中內源酶相對應，這類酶就稱為外源酶，主要包括蛋白水解酶類，如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶，以及一些動物、微生物來源的蛋白酶。另外，屬于轉移酶類的谷氨酰胺轉胺酶由于其酰胺基轉移功能而具有的蛋白交聯作用而廣泛進行了在肉制品的應用研究。此外，多酚氧化酶由于具有氧化還原活性，可將在蛋白質中的—SH氧化成二硫鍵而使蛋白分子內部與分子之間形成交聯，未來可能在肉品加工也有潛在應用。酶作為一類特殊的食品添加劑，其種類和質量逐年提升，在肉品加工過程中的應用也不斷增強。與普通的食品添加劑相比，酶反應表現為特別溫和、綠色與環保，這對減少肉的營養和風味損失、提高肉品質量和安全性具有重要作用。為此，根據近些年來的研究報道，對以上內容作一綜述，旨在強調食品用酶在肉品加工中的重要作用，拓展與提升外源酶在肉品加工中的應用技術。

1 常見肉及肉制品加工用酶

肉品加工用酶種類較多，來源分散，根據酶催化反應類型，將其基本分為3類：水解酶、轉移酶和氧化還原酶，其具體名稱、分類、催化活性等酶學性質以及應用列于表1。

1.1 水解酶類

水解酶是催化水解反應的一類酶的總稱。水解酶是以(底物)水解酶這種格式來命名。但是，一般的名稱是(底物)酶，可分為淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。不同種類的水解酶在食品加工中均有廣泛應用，而在肉品中應用的主要是蛋白酶。在蛋白酶的作用下，將肉類大分子蛋白質水解為易吸收的蛋白胨、多肽及各種氨基酸，從而提高了肉品嫩度、風味等[21]。蛋白酶從動、植物以及微生物中均可獲取。

來源于植物的蛋白酶主要包括木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、中華獼猴桃蛋白酶、生姜蛋白酶，以及一些富含蛋白酶活性的植物提取物。植物水解蛋白酶的共同點是，活性中心都具有半胱氨酸殘基，屬于巰基蛋白酶，并對催化位點沒有特異性，主要以內肽酶的形態起作用。能切開全蛋蛋白質分子內部肽鏈—CO—NH—生成分子質量較小的多肽類，從而使大分子的蛋白質水解成易吸收的小分子氨基酸和多肽。植物源蛋白酶在肉品加工的主要作用是肉質嫩化。

來源于動物的蛋白酶主要是胃蛋白酶和胰蛋白酶，以及一些魚類或動物內臟提取的蛋白酶[22]。其中胃蛋白酶是一種消化性蛋白酶，由胃部中的胃黏膜主細胞分泌，功能是將食品的蛋白質分解為小的肽片段，對蛋白或多肽進行剪切時，具有一定的氨基酸序列特異性。它傾向于剪切氨基端或羧基端為芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或亮氨酸的肽鍵；而如果某一肽鍵氨基端數第3個氨基酸為堿性氨基酸(如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)或者該肽鍵的氨基端為精氨酸時，則不能有效地對此肽鍵進行剪切。這種剪切特異性在pH1.3時表現得更為明顯，即只傾向于剪切氨基端。而胰蛋白酶在脊椎動物中，作為消化酶而起作用。其作為胰液的成分而分泌，受腸激酶或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內切酶，能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷。它是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，成為不可缺少的工具[1]。這類蛋白酶真正在肉品加工過程中的應用并不多見，主要是對肉及畜禽副產物進行酶解以提取某些活性肽等功能物質。

表1 用于肉及肉制品加工過程中的外源酶種類及性質Table 1 Types and properties of exogenous enzymes during meat processing

除了植物蛋白酶外，微生物來源的蛋白酶也具有較強的蛋白水解作用，如枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、米曲霉蛋白酶等，具有代表性的是枯草桿菌中性蛋白酶。中性蛋白酶是一種能在中性范圍內將大分子蛋白質迅速水解成肽類和部分游離氨基酸的胞外酶，廣泛用于食品工業[23]。中性蛋白酶由于肽鍵的親核進攻而造成蛋白質的水解可以嫩化。除了嫩化作用外，真菌蛋白酶可能在干發酵香腸的風味形成中也發揮著作用。

1.2 轉移酶類

轉移酶類能夠催化化合物某些基團的轉移，其中應用最為廣泛的是谷氨酰胺轉胺酶。谷氨酰胺轉胺酶(蛋白質谷氨酰胺-谷氨酰基轉移酶，簡稱TG)，又稱轉谷氨酰胺酶，是催化蛋白質或多肽鏈中的谷氨酰胺殘基里的C2酰胺基和一級氨基之間進行酰胺基轉移反應的酶。蛋白質中的賴氨酸殘基里的E2氨基也可以作為一級氨基與之反應，從而可以將蛋白質進行分子內或分子間的共價交聯聚合。TG的最適pH值是5～8，活性最穩定的溫度是40℃，超過40℃逐漸減弱。TG經研究表明存在于哺乳動物中幾乎所有的組織里，在鳥類、魚類及多種植物中也廣泛分布，但這些動物性TG都是Ca2+依賴型的。但由于來源有限和提高工藝復雜等原因限制，真正工業化生產的TG是來自于微生物，如輪枝鏈霉菌(Streptoverticillium sp.)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等[24]。TG已廣泛應用于食品加工業，其中在肉制品中添加谷氨酰胺轉胺酶可以促進蛋白質分子交聯，改善肉制品品質，降低生產成本，提高產品附加值。

1.3 氧化還原酶類

氧化還原酶類作為酶類中的特殊類別，在食品工業中仍未能廣泛使用，在肉品加工中更不多見，具有代表性的是多酚氧化酶。多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是自然界中分布極廣的一種金屬蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆蟲的質體中，甚至在土壤中腐爛的植物殘渣上都可以檢測到PPO的活性。它是一類廣泛存在的含銅金屬酶類，能夠通過分子氧氧化酚或多酚形成對應的醌，廣義上的PPO可以分為酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶都屬于氧化還原酶類。PPO可催化蛋白發生交聯反應，從而改善蛋白質的功能特性，如熱穩定性、乳化性、凝膠特性、保水性、流變學特性等[25-26]。

2 外源酶在肉品加工過程中的蛋白水解作用

2.1 外源酶對肉質嫩化的作用

肉的嫩度通常被認為是肉品質量的最重要的決定因素之一。肉的嫩度取決于肌內結締組織的量、肌小節的長度和潛在的肌肉中蛋白水解的能力[3]。從另一方面來看，肉的嫩度是消費者在肉質品質中非常重視的一點[27]。外源性蛋白酶處理是最有效肉嫩化的方法之一。用于肉類嫩化的酶類主要有兩種來源，植物中提取和微生物培養。植物中提取的酶類主要有木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中華獼猴桃蛋白酶、無花果蛋白酶及生姜蛋白酶等已被廣泛應用于嫩肉粉的制備與生產中[14,28-30]。Ha等[31]研究發現木瓜蛋白酶、生姜蛋白酶、中華獼猴桃蛋白酶和菠蘿蛋白酶4種植物水解蛋白酶都能有效地水解牛肉中的肌原纖維和膠原蛋白，其中中華獼猴桃蛋白酶被發現是最有效的水解牛肉中肌原纖維蛋白的植物水解蛋白酶，而生姜蛋白酶被認為是水解膠原蛋白最有效的植物蛋白酶。Kim等[7]經過研究表明來源于生姜的半胱氨酸蛋白酶具有很強的膠原蛋白水解活性。蘆筍是一種鮮美蔬菜，同時具有較高的蛋白酶活性。Ha等[32]比較了中華獼猴桃蛋白酶和蘆筍蛋白酶的蛋白水解活性，并根據它們對肌原纖維和結締組織蛋白水解活性的差異提出了如何以此開發肉嫩化劑。

一些來源于真菌的蛋白酶由于對結締組織有較強的分解作用，嫩化效果十分顯著。Sullivan等[14]應用芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌蛋白酶、米曲霉蛋白酶對牛肉進行處理，發現所有的酶處理可以增加肌原纖維和膠原蛋白的降解從而使肌肉嫩化提高感官效果。除了傳統的植物和微生物水解蛋白酶，近年來有學者研究膠原蛋白酶嫩化肉質。Zhao Guoyan等[33]研究了膠原蛋白酶MPC-01在低溫條件下對牛肉有顯著的嫩化效果。另外，來源于Pseudomonas fl uorescens的蛋白酶提高了豬肉和大西洋斜鋸牙鯊(Rhizoprionodon terraenovae)中蛋白質的乳化性能[34]。隨著對微生物蛋白酶的研究深入，發現微生物產酶易于誘變育種，提高產量，易于生產、分離純化，成本低而動植物資源有限，微生物蛋白水解酶嫩化肉制品是有研究和應用價值的。

由于受酶制劑價格因素和對天然、綠色食品的追求，人們也研究一些富含蛋白酶活性的提取物對肉質嫩化的作用，目前報道的有來源于植物的中華獼猴、Calotropis procera，以及傳統發酵食品-大醬等[35-37]。理論上講，凡是能夠作為蛋白酶提取原料或具有蛋白酶活性的動、植物及微生物及其代謝產物，均可以粗提物的方式應用于肉品加工，但是由于未經過純化，其所含其他成分對肉品的色澤、質地、安全性以及對蛋白酶活本身都會產生很大影響，其在具體應用前進行詳細深入研究。無論如何，富含蛋白酶活性提取物的添加也已成為外源酶在肉品加工的新手段。

2.2 外源酶在動物源性活性多肽中的作用

生物活性肽的定義是由Biesalski等[38]提出的，被定義為對身體機能和健康有積極作用的特定蛋白質片段[39]。肉類來源的包括肌肽、鵝肌肽、谷胱甘肽和肌酸等在內的生物活性肽，已被研究者們廣泛關注。此外，近年來開發的一些新型的肉源多肽，如抗高血壓活性肽、阿片樣活性肽、抗氧化活性肽、免疫調節活性肽、抗血栓活性肽等，成為另一類很有潛在應用的功能性成分[40-41]。在生物活性肽的生產中，外源酶應用廣泛[38,42-43]，以具有水解特異性較強的胃蛋白酶、胰蛋白酶等比較常見。實際生產中，不同的外源酶產生的生物活性肽是不同的[40]，以此為基礎可開發出功能各異、特定片段的生物活性肽。

2.3 外源酶對肉制品風味的影響

外源酶對肉制品風味的影響部分來自于其對蛋白質的水解。Diaz等[44]從3個蛋白酶天冬蛋白酶E、米曲霉蛋白酶和木瓜蛋白酶對干發酵香腸的特性進行了研究，發現添加外源性酶能夠促進干發酵香腸產生芳香族化合物。Chaves-lópez等[45]應用釀酒酵母中的水解酶促使胱氨酸、谷氨酸、賴氨酸、纈氨酸等自由氨基酸的增多從而影響了意大利風干香腸的風味。He Hailun等[46]比較了來源于Pseudoaltermonas sp. SM9913菌株的適冷性蛋白酶(cold-adapted protease)和來源于Mesophilic Bacterium Bacillus sp. SM98011菌株的Mesophilic Protease對冷凍肉風味的影響，表明在冷藏條件下，適冷性蛋白酶比Mesophilic Protease更能夠釋放更多的呈味氨基酸，從而可作為一種傳統中溫蛋白酶的代替品而在提高冷凍肉風味中有潛在應用。研究表明蛋白酶能加速蛋白質的水解，提高游離氨基酸含量、風味肽及其他風味物質，有利于產品風味的形成，從而改善提高產品的品質。水解酶能在生產中增加肉制品的自由氨基酸和風味肽從而提高肉制品的特有風味，對改良傳統肉制品有重要的研究意義。

3 外源酶在肉品加工過程中的蛋白交聯作用

在肉制品中，提高蛋白質的交聯程度可以增加肉質的保水性，改善肉的凝膠特性，提高肉制品品質。TG酶可以通過催化蛋白質分子之間發生的交聯，改善蛋白質的許多重要性能以及食品質構，如用該酶生產重組肉時，它不僅可將碎肉黏結在一起，還可以將各種非肉蛋白交聯到肉蛋白上，明顯改善肉制品的口感、風味、組織結構和營養。Ahhmed等[47]研究了TG對雞肉和牛肉香腸的凝膠強度的影響，結果表明通過TG的添加可以提高肉糜熱誘導凝膠的強度。Carbalo等[48]研究了TG對不同種類的肉凝膠特性的影響，系列研究表明，TG處理能顯著提高肉的凝膠強度，在一定的條件下還能減少蒸煮損失、增強凝膠的持水力。段茂華等[15]利用轉谷氨酰胺酶的交聯作用對牛肉原料進行處理。以負重值為主要檢測指標，考察了酶處理對牛肉質構的影響。結果表明，與對照組相比，經酶處理后的牛肉表現出較好的質構強度，有利于產品的后續加工。Basaran等[49]研究了TG對雞肉鱒魚和鮭魚的肌肉發現，TG催化促進蛋白質的交聯和凝膠形成，代替鹽或磷酸鹽。除了利用TG促進肉蛋白質的交聯研究外，很多學者對TG對肉蛋白質與非肉蛋白質的交聯作用也進行了研究，Pietrasik等[50]研究了TG對乳蛋白質與肌肉蛋白質混合物的處理效果，結果表明在相同的總蛋白濃度下，TG處理可促進乳蛋白質與肌肉蛋白質的交聯，增加熱誘導凝膠的持水力，同時還能形成更強的凝膠。

除了TG外，多酚氧化酶和脂肪氧合酶由于可作用于蛋白質中的巰基和二硫鍵，可以形成酪氨酸-酪氨酸、酪氨酸-半胱氨酸或酪氨酸-賴氨酸等交聯[20,25]，因此，在能夠提高肉品結構方面可能具有潛在應用價值。

4 外源酶在肉制品加工過程中的其他作用

外源酶在肉的抗氧化、風味(非蛋白水解作用)、抗菌防腐等方面也具有一定作用。由于蛋白酶可將蛋白質降解成許多具有抗氧化活性的多肽等小分子物質，從而可能提高伊比利亞干發酵香腸的氧化穩定性[51-52]。Pradhan等[53]發現，過氧化氫酶在肉的存放時有助于肉質產品中的抗氧化。另外，一些氧化還原酶對肉制品的風味也有影響。其中脂酶與動物風味形成有關。Fernández等[54-55]研究了添加胰脂酶對于干發酵香腸脂肪降解、微生物指標和感官質量的影響，添加胰脂酶對發酵香腸的三酰甘油尤其是二酰甘油酯的降解和游離脂肪酸的積累有明顯的促進作用，肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸的含量均有明顯的增加，對于干發酵香腸的風味形成有促進作用。溶菌酶作為一種廣泛存在于動、植物組織以及微生物中的蛋白質，能夠水解細胞壁和外膜層中肽聚糖的糖苷鍵和酰胺鍵，破壞細胞壁網狀結構，使細胞壁溶解，從而使微生物在沒有細胞壁的保護下而死亡。另外，溶菌酶作為一類天然生物防腐劑，在肉制品加工中的應用研究正在不斷深入與拓展，一般以與其他防腐物質配合使用，如殼聚糖、Nisin、植物精油等[56-57]，在肉制品的生物防腐領域占有重要位置。

5 結 語

在肉及肉制品加工過程中，外源酶不僅可以大大改善肌肉蛋白質的嫩化程度、凝膠特性，生產高質量的肉制品，還能夠用于開發新的食品資源，改善肉制品的風味，以及生產有益于健康的生物活性肽。隨著新酶種類的不斷挖掘和應用技術的不斷革新，外源酶在肉品加工中的應用范圍和程度將會不斷擴大。除了廣泛應用于蛋白水解和交聯的植物蛋白酶、TG等，其對肉品風味、抗氧化有貢獻的一些蛋白酶、脂肪酶也將會不斷地得到開發。由于來源廣泛和提取技術的差異，外源酶純度、活性等技術指標存在很大差異，其使用安全性也將是肉類加工者應考慮和對待的問題。外源酶的應用將為我國肉類工業在提高產品質量、降低成本、節約原料和資源、保護環境等方面產生了巨大的社會效益和經濟效益。

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