甘油體系研究奶糖內源性甲醛的生成機理

陳 梅，呂春華，朱曉雨，陳笑梅,*，莫衛民

(1.浙江工業大學化學工程與材料學院，浙江 杭州 310014；2.浙江出入境檢驗檢疫局，浙江 杭州 310016)

甲醛具有較高的毒性，已被世界衛生組織(WHO)確定為致癌和致畸的物質。近年來，“大白兔奶糖含甲醛”、食品中違禁使用吊白塊和水發產品用甲醛浸泡等事件頻繁發生，已成為全球關注的焦點。大量研究[1]表明甲醛可在動植物體內自然產生，是一種自身的代謝產物，是某些氨基酸生物合成所必需的前提物質。Yamagata等[2]發現甲醛可在一些蔬菜、水果、發酵制品中自然產生，Bianchi等[3]在水產中檢測到有較高本底含量的內源性甲醛。張文德[4]發現食用菌類、水產品、果蔬類、糧食類、乳制品等食品中均含有天然甲醛。馬永均等[5]調查表明，在66個水果樣品中，甲醛含量超過1.0mg/kg的有11個，1.0～0.5mg/kg的有22個，小于0.5mg/kg的有33個。水果(植物)呼吸作用使復雜的有機物質在酶的作用下緩慢分解為簡單有機物——醇類、酮類、醛類以及CO2和水等，在細胞代謝的生化過程中會產生微量的甲醛。乳品中的甲醛來源于乳脂肪的酶類反應和氨基化合物等物質的美拉德反應，是復雜反應過程中代謝或產生的中間產物[4]。各種乳制品中能測出包括甲醛在內的多種羰基化合物，鮮牛乳中曾分離出甲醛、乙醛、丙醛、己醛、苯甲醛等物質[4]，乳酸菌都有生產甲醛及乙醛的能力，例如，在蛋白質分解酶的作用下，乳蛋白生成肽、氨基酸類化合物在微生物的作用下脫去氨基后，可以轉變為醛、酮、醇類，產生奶酪特有的風味[6]。文獻[7-9]報道，食品中內源性甲醛的生成也可能和其加工的工藝有關。

乳制品含有豐富的蛋白質和還原糖，其主要蛋白——酪蛋白和乳清蛋白的賴氨酸殘基活性較強，易與乳糖發生美拉德反應[10]。文獻[11]報道美拉德反應原理為Amadori產物裂解產生羰基和α-二羰基化合物會繼續與氨基化合物反應，使氨基化合物失去1分子CO2生成少1個碳原子的醛類。馮大炎等[12]認為面包烘烤時美拉德反應和Strecker降解反應同時進行產生了一些醛酮類物質，如甲醛、丙醛、異戊醛等。陳華[13]認為相等量的甘氨酸和葡萄糖混合加熱100～150℃時產生的Strecker醛類為甲醛。

本實驗針對奶糖中的甲醛問題，調查奶糖原料乳粉和糖類中甲醛的本底含量及其高溫處理后甲醛含量的變化；找出乳粉是奶糖內源性甲醛形成的關鍵物質，進一步分析乳粉高溫體系甲醛生成的特性；模擬奶糖熬糖工藝，考察不同糖類的添加對乳粉高溫處理甲醛生成的影響；通過對乳粉主要成分分析進一步找出乳粉中甲醛形成的關鍵物質并驗證其高溫反應特性，以期闡明奶糖中內源性甲醛生成的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白兔牌奶糖為市售；伊利、光明、雅士利等品牌乳粉(蛋白質含量18.5%～40.0%、乳糖含量31.5%～54.8%)為市售。

甲醛標準溶液(100μg/mL) 環境保護部標準樣品研究所；2,4-二硝基苯肼(DNPH，優級純) 國藥集團化學試劑有限公司；酪蛋白、乳清蛋白 上海源聚生物科技有限公司；乳糖 上海伯奧生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、果糖 美國Acros Organics公司；甘油 江蘇強盛化工有限公司；乙腈、甲醇(色譜純) 美國Tedia公司；所有試劑均為分析純，所用水為去離子水。

配制的DNPH溶液：稱取DNPH 0.50g，用乙腈溶解并定容至250mL，質量濃度為2g/L。pH5磷酸鹽緩沖液：稱取13.6g KH2PO4，加入500mL水中，混勻后用NaOH溶液調至pH5.0。配制的衍生液：將DNPH溶液與pH5.0磷酸鹽緩沖液，按體積比1：1混合。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200高效液相色譜儀(配G1315B二極管陣列檢測器) 美國Agilent公司；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；恒溫振蕩器 太倉市科教器材廠；高速離心機 美國Thermo公司；電子天平(感量0.0001g) 瑞士Mettler Toledo公司；旋渦混合器 太倉華利達實驗室設備公司。

1.3 方法

1.3.1 甲醛生成模擬與定量

稱取2.25g甘油于8mL螺紋口樣品瓶中，加入0.25g樣品(乳粉、酪蛋白、乳清蛋白)，再按一定比例加入一定量的糖(糖添加實驗、乳粉內源性甲醛生成因子探究實驗)，旋緊螺帽。于80℃水浴中靜置10min，渦旋混勻。置于烘箱中120℃加熱60min。

1.3.2 甲醛生成特性

參考1.3.1節準備樣品。在相同加熱時間條件下，將完全混勻的樣品分別置于60、80、100、120℃加熱60min；相同加熱溫度條件下，將全混勻的樣品置于120℃烘箱中分別加熱20、40、60、80、100min。

1.3.3 甲醛的測定

1.3.3.1 甲醛的衍生反應

常溫條件下，稱取2.00g樣品于50mL塑料離心管中，加入20mL衍生液。高溫處理后的樣品，用20mL衍生液將反應產物轉移至50mL塑料離心管中。旋緊管塞，渦旋混勻。置于60℃恒溫振蕩器中，150r/min振搖提取60min，取出冷卻至室溫。

1.3.3.2 凈化

將1.3.3.1節的提取液，以不低于4000r/min離心5min。若離心后溶液澄清，過0.45μm微孔濾膜，濾液供HPLC法測定。若離心后溶液渾濁或分層，在提取液中加入8g硫酸銨，混勻，以不低于4000r/min離心5min。移取上清液于20mL刻度試管中，下層溶液用10mL乙腈重復萃取1次，合并上清液，用乙腈定容至20.0mL，混勻后過0.45μm微孔濾膜，濾液供HPLC法測定。

1.3.4 甲醛衍生物標準溶液的制備

[14]，分別移取適量的甲醛標準溶液，于10mL具塞刻度試管中，用衍生液定容至10mL。蓋上塞后混勻，于60℃水浴中加熱60min，取出冷卻至室溫。溶液過0.45μm微孔濾膜，濾液供HPLC法測定。高溫體系甲醛的測定實驗，甲醛標準的衍生體系中需分別加甘油0.90g，參見上述操作制備。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Agilent色譜柱C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-水(60：40，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫30℃； 檢測波長：350nm；進樣量：10μL。

2 結果與分析

2.1 高溫處理中甲醛的收集及檢測方法的研究

2.1.1 高溫處理中甲醛收集方法的研究

奶糖熬糖工藝在120℃，為研究在此溫度條件下奶糖及其各成分甲醛的含量變化，首先需研究這些物質在高溫處理時甲醛的收集方法。因甲醛是揮發性物質，奶糖及其各成分經高溫處理產生的甲醛，若沒有收集直接冷卻測定，甲醛將部分揮發。本實驗比較了甘油體系和水體系對奶糖經高溫處理產生的甲醛的收集效果，結果表明，甘油體系的實驗結果重現性較好。甘油沸點較高，120℃時仍為液態，反應體系的均勻性和熱傳導性較好；水沸點為100℃，120℃時轉化為氣態，揮發帶走部分甲醛，反應體系均勻性不佳，對實驗裝置的密封性要求高，而且存在因壓力過大爆炸的風險。

2.1.2 甘油體系中甲醛檢測方法的研究

參考文獻[15]，衍生液提取法能夠有效提取樣品中游離態和可逆結合態的甲醛，同時避免樣品中內源性甲醛的形成，是一種較合理的前處理方法。文獻中甲醛的衍生反應在水-乙腈(1：1，V/V)的體系中進行，本實驗甲醛的衍生體系中含有甘油，需考察甘油對衍生反應的影響。在甲醛衍生物標準溶液中加入一定量的甘油，通過比較衍生產物的峰面積考察甘油對甲醛衍生反應的影響，結果表明：甘油含量≤2mL時，甲醛衍生物的峰面積與不加甘油時相比，誤差在5%以內。此時，甲醛標準溶液 0.2～10.0m/kg的線性方程為y=345.8x+20.33，相關系數R2≥0.99990。甘油含量＞2mL，試劑空白偏高，線性關系不佳。

2.2 高溫處理對奶糖主要成分糖類甲醛生成的影響

圖 1 奶糖經高溫處理后甲醛含量的變化Fig.1 Change of formaldehyde content in different carbohydrates treated at 120 ℃ for 60 min

考察奶糖的主要原料糖類經高溫處理后甲醛含量的變化，以探究奶糖中內源性甲醛生成的主要原因。見圖1。糖類的甲醛本底值均較低，高溫處理后4種糖的甲醛含量略有增加，其中葡萄糖中的甲醛含量變化最大，由0.46mg/kg增加到5.65mg/kg。糖類中甲醛略有增加，可能是因為糖類物質高溫時分解產生小分子質量代謝產物甲醛[16]。

2.3 高溫處理對奶糖原料乳粉甲醛生成的影響

如圖2所示，6種乳粉的甲醛本底值為0.58～2.97mg/kg，高溫處理后甲醛含量增加至12.6～23.7mg/kg。6種乳粉中A、B、C、D、E為成人乳粉，F為嬰兒乳粉，表明乳粉高溫處理后甲醛含量顯著增加具有普遍性。A、B為同一品牌的脫脂乳粉和全脂乳粉，高溫處理后甲醛含量分別為15.9、12.6mg/kg，無顯著性差異(P＞0.05)，表明乳粉中脂肪不是影響高溫甲醛生成的主要因素。

圖 2 乳粉經高溫處理后甲醛含量的變化Fig.2 Change of formaldehyde content in different milk powder treated at 120 ℃ for 60 min

2.4 乳粉高溫體系甲醛生成的影響因素

2.4.1 加熱溫度和時間對乳粉甲醛生成的影響

圖 3 乳粉-甘油體系甲醛生成的溫度曲線(a)和時間曲線(b)Fig.3 Temperature curve (a) and time curve (b) for the generation of formaldehyde in milk powder-glycerin system

由圖3a可知，隨著加熱溫度升高甲醛含量增加。溫度高于80℃時，甲醛生成顯著(P＜0.05)；加熱溫度為100℃和120℃時，甲醛含量分別是本底值的16.9倍和34.6倍。由圖3b可知，加熱時間為20～60min時，甲醛生成量隨加熱時間延長而顯著增加(P＜0.05)，至60min時，甲醛的生成量達到最大；在60～100min之間甲醛生成速率變緩。馬志玲等[10]研究表明熱處理的強度越大，乳糖與賴氨酸殘基的結合越強烈，美拉德反應越容易進行。實驗結果也表明，溫度大于80℃，加熱時間越長，產生的甲醛含量越多，超過60min后，甲醛含量基本不變。因此選擇乳粉-甘油體系120℃高溫處理60min作為乳粉高溫體系處理條件。

2.4.2 糖類添加對乳粉高溫處理甲醛生成的影響

由圖4可知，隨著乳糖、葡萄糖、果糖量增加，甲醛生成量隨之增大；其中葡萄糖的添加影響最顯著(P＜0.05)，甲醛的最高生成量為182.5mg/kg，果糖和乳糖次之，甲醛的最高生成量分別為45.9、31.9mg/kg，蔗糖添加對甲醛生成影響不明顯。4種糖添加對乳粉高溫處理甲醛生成影響的順序為葡萄糖＞果糖＞乳糖＞蔗糖，這與Mauron[17]的研究結果一致，即美拉德反應的難易順序為五碳醛糖＞己醛糖＞己酮糖＞雙糖。蔗糖、乳糖為雙糖，還原性較弱，反應活性小于單糖。吳惠玲等[18]的研究表明，蔗糖是非還原糖，不含游離的羰基，沒有顯示出與氨基酸的反應活性。因此添加蔗糖不會導致乳粉熱處理甲醛含量的升高。葡萄糖為醛糖，果糖為酮糖，醛糖的末端基團位阻效應小，更易于氨基化合物反應，因此葡萄糖的反應活性大于果糖的反應活性[16]。

2.5 乳粉內源性甲醛生成主要因子的探究

圖 5 酪蛋白(乳清蛋白)-乳糖-甘油體系高溫甲醛的生成Fig.5 The generation of formaldehyde in casein (whey protein)-lactoseglycerin system treated at 120 ℃ for 60 min

美拉德反應主要是羰基化合物和氨基化合物間的反應。牛乳中90%以上的蛋白質為酪蛋白和乳清蛋白，且這兩種蛋白的賴氨酸殘基都有很高的反應活性，較易與還原糖乳糖反應[10,19]。如圖5所示，酪蛋白高溫甲醛的生成量隨著乳糖的添加增加較明顯，至質量比為1：5時甲醛的生成量最大。乳清蛋白高溫甲醛的生成不明顯。這是因為酪蛋白對熱不敏感，而乳清蛋白熱處理時容易變性[20]。因此，乳清蛋白熱處理時賴氨酸殘基失活，影響美拉德反應導致甲醛生成不明顯。

酪蛋白-乳糖-甘油體系在高溫條件下甲醛生成量的變化趨勢與乳粉-乳糖-甘油體系的趨勢一致，而且生成的甲醛量也相近，見圖4a，當乳粉與乳糖1：1混合時，乳粉生成的甲醛量最高。因實驗所用乳粉中酪蛋白含量為26.4%，乳糖含量為47.3%，乳粉與乳糖含量為1：1相當于酪蛋白與乳糖的質量比為1：5.6。這與圖5中酪蛋白與乳糖比為1：5時，生成的甲醛量最多相吻合。當乳粉與乳糖質量比為1：1混合時，乳粉甲醛的生成量為31.9mg/kg，酪蛋白在乳粉中的含量為26.4%，相當于每千克酪蛋白產生的甲醛量為120.8mg。這與圖5中酪蛋白與乳糖質量比為1：5時，酪蛋白產生甲醛的生成量為130.4mg/kg相近。因此，乳粉內源性甲醛的生成主要是由酪蛋白和乳糖發生美拉德反應產生的。

2.6 酪蛋白-乳糖-甘油模擬體系高溫甲醛生成的特點

考察加熱溫度和時間對酪蛋白-乳糖-甘油體系(酪蛋白、乳糖添加質量比為1：3)甲醛生成的影響，見圖6。該體系低于80℃處理時甲醛的生成不明顯，高于80℃處理時甲醛的生成開始顯著增加，120℃時甲醛含量最高。這與圖3a乳粉-甘油體系高溫甲醛生成的趨勢相似。體系在加熱20～60min時，甲醛的生成隨著加熱時間的延長逐漸增加，到60min時甲醛的生成最明顯，60min后甲醛的生成量基本不變。與圖3b乳粉-甘油體系高溫甲醛生成的趨勢相似。因此，酪蛋白-乳糖-甘油體系高溫甲醛的消長趨勢與乳粉-甘油體系高溫甲醛的消長趨勢相似。

圖 6 酪蛋白-乳糖-甘油體系甲醛生成的溫度曲線(a)和時間曲線(b)Fig.6 Temperature curve (a) and time curve (b) of the generation of formaldehyde in casein-lactose-glycerin system

3 結 論

本實驗研究了甘油體系收集樣品經高溫處理生成甲醛的方法及收集后甲醛的檢測方法。通過對奶糖主要成分乳粉和糖類進行研究，發現乳粉是奶糖中甲醛生成的主要物質，在分析乳粉主要成分蛋白和糖類時發現酪蛋白和乳糖的美拉德反應是奶糖甲醛生成的根本原因。乳清蛋白對甲醛的生成基本無影響，不同糖類的影響也不同，依次為葡萄糖＞果糖＞乳糖＞蔗糖。

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