微衛星在釀酒酵母研究中的應用

馮 敏，劉延琳*

(西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100)

微衛星DNA由短的核心序列(一般1～6bp)串聯重復構成，故也被稱為簡單重復序列(simple sequence repeats, SSRs)，如(CA)n、(GTG)n等，其中雙核苷酸重復最為常見，其次為3個核苷酸或者4個核苷酸的重復。微衛星在真核生物基因組中廣泛存在且均勻分布，在酵母中，每100kb就有1.8個微衛星位點[1-2]。自釀酒酵母全基因組序列公布以后，科學家開始構建搜索釀酒酵母微衛星序列的方法，并取得顯著成果[2-5]。因微衛星在真核生物基因組中種類多、分布廣，呈選擇中性和共顯性遺傳，多態性豐富且在種內高度保守，一些學者已將微衛星位點的組合分析用于釀酒酵母分型和遺傳多樣性研究，但尚未達到該技術的最大分辨率[6-9]。鑒于此，Legras等[10-11]對41個微衛星位點的多態信息進行評估和篩選，得到6個穩定的高變異微衛星位點，而這6個位點豐富的多態性也在隨后其他學者的研究中得到認可。近年來，隨著微衛星序列搜索技術、引物開發技術和檢測分析技術的不斷完善，其在釀酒酵母相關研究中得到了更為廣泛的應用，并呈現出廣闊的發展前景。

1 微衛星的應用原理

1.1 微衛星位點多態性形成機理

微衛星DNA因其核心序列重復次數不同及重復程度不同形成了每個座位的多態性[12]，而重復次數的差異是DNA復制和修復過程中滑動錯配或減數分裂過程中非姐妹染色單體的不等交換所致[13-14]。而微衛星的進化則是通過鏈滑移而非重組[15]。此外，Messier等[16]認為微衛星序列越長，其多態性也越豐富，其原因是在DNA復制或者修復時，滑動鏈與互補鏈堿基錯配，如果錯配不能修復，將會導致一個或幾個重復單位的插入或缺失。而微衛星越長，產生錯配的機會越大，微衛星多態性也越豐富。

1.2 微衛星位點分析方法

1.2.1 分析原理

微衛星核心序列兩側的側翼序列在種內高度保守，這是設計適當引物擴增微衛星核心序列的基礎。基于側翼序列在種內高度的特異性和核心序列因重復次數差異產生的多態性，可使用某微衛星位點的特異引物，以不同個體的基因組DNA為模板，對該位點的核心序列進行PCR擴增。若同源染色體某個微衛星位點的核心序列重復數目相同，則該個體在這個位點是純合的，否則便是雜合的。

1.2.2 分析方法

微衛星PCR結果經聚丙烯酰胺凝膠電泳，毛細管電泳檢測或者測序后，通過POPGENE1.32，Microsatellite_tool kit，GENEPOP1.2等軟件對微衛星位點的等位基因數、基因雜合度(heterozygosity，H)和多態信息含量(polymorphism information content，PIC)是衡量群體微衛星變異程度的指標)進行統計分析[17-19]。利用AMOVA、NTSYSpc 2.0、PHYLIP3.6等分析釀酒酵母菌株親緣關系、釀酒酵母群體的遺傳關系等[20-22]。

1.2.3 釀酒酵母研究中常用微衛星位點信息

常用微衛星位點信息見表1。

2 微衛星在釀酒酵母分類鑒定中的應用

2.1 微衛星用于鑒定釀酒酵母

Schuller等[28]分別用6個微衛星位點PCR、interdelta序列分析和線粒體DNA HinfⅠ酶切3種方法考察23株商業酵母，每種方法均得到21種基因型，Schuller指出這3種方法均可作為鑒定釀酒酵母的常規方法在釀酒工業中廣泛應用。Vaudano等[29]利用3個微衛星位點多重PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳，對30株釀酒酵母商業菌株進行區分，其中除DSM Fermivin和Laffort Zymaflore ST兩株菌之外，其余28株菌表現出明顯的帶型差異。此外，他還對所選微衛星標記的穩定性及實驗方法的可重復性進行驗證，指出微衛星標記穩定性好，靈敏度高，可用于檢測工業發酵中野生酵母的污染。Howell等[26]通過微衛星位點SC8132X對6個釀酒酵母群體進行分型，得到4個多態類群，從中選擇3種不同分型的菌株混合發酵，利用微衛星PCR對發酵過程中釀酒酵母種群進行監控，指出發酵是一個動態變化過程，發酵始末釀酒酵母群體結構存在差異。Pérez等[9]從10個微衛星位點中選出6個高多態性位點，對來自不同酒廠的51株釀酒酵母進行區分，得到57個等位基因和44個基因型。Pérez指出多個微衛星位點組合分析具有很高的分辨率。González Techera等[23]曾對烏拉圭的6株本土釀酒酵母和3株商業釀酒酵母進行區分，通過3個微衛星位點PCR擴增和多態性分析，成功區分上述9個菌株。他認為由于微衛星分型結果可轉換為數量數據，故比其他分型技術具有更大的優越性，并提議可將該方法作為鑒定釀酒酵母的常規方法。

2.2 微衛星用于構建釀酒酵母菌株分型數據庫

Jubany等[24]曾提出基于微衛星位點和SNPs對釀酒酵母菌株進行分型的標準方法，他們利用從33個微衛星位點中篩選出的9個高多態性位點對120個菌株進行分析，并結合FLO8的SNPs分析，初步構建釀酒酵母菌株微衛星和SNPs分型數據庫(www.pasteur.edu.uy/yeast)，旨在收集和規范來自不同實驗室的數據。Jubany選擇S288C和AB972作為參考菌株，供試菌株某位點的分析結果以其與參考菌株該位點的重復數差異來表示，比如，+4表示供試菌株比參考菌株在該位點多4個重復，而－7則表示比參考菌株少7個重復。這種用重復數差異來表示等位基因的方法，第一次使得不同實驗室之間實驗結果的交換和共享成為可能。隨后Richards等[25]基于10個微衛星位點和MAT位點構建了另一個釀酒酵母分型數據庫，該數據庫包含246個菌株：78株葡萄酒商業酵母、103株世界各地的野生酵母、34株由 Saccharomyces genome resequencing project(SGRP)測序的野生酵母、31株新西蘭酒廠分離的酵母。故可直接比較這34個菌株DNA序列數據與微衛星基因型之間的關系。該研究首次提出建立菌株DNA序列與微衛星基因型之間的對應關系。

表 1 常用微衛星位點信息Table 1 Characteristics and primers of hypervariable SSR loci in Saccharomyces cerevisiae

3 微衛星在釀酒酵母菌株倍性確定中的應用

Ezov等[30]從以色列和美國卡梅爾的“進化峽谷”分離得到68個野生釀酒酵母單菌落，利用19對微衛星引物進行PCR擴增，并對每個位點等位基因數目和雜合度進行計算，發現所選19個位點都具有較高的等位基因多態性，平均每株菌每個位點有5.1個等位基因。Ezov認為如果一個菌株每個位點有1～4個等位基因，這便預示著該菌株可能為多倍體，他預測68株釀酒酵母中包含有二倍體、三倍體，甚至還有四倍體。之后通過流式細胞術分析(flow cytometry analysis，FACS)，Ezov的預測得到確認，分別有21個二倍體菌株，7個三倍體和40個四倍體。Muller等[31]選擇12個微衛星位點對170株臨床和非臨床釀酒酵母菌株進行分析，得到161種基因型，每個位點有16～42個等位基因，平均每個位點有27個等位基因。而每株菌每個位點都有1～4個等位基因，暗示這些菌株存在倍性差異。Muller預測55%的菌株是二倍體，14%為三倍體，11%為四倍體。最后，臨床菌株雜合子的比例高于非臨床菌株，暗示在臨床環境中雜合子菌株的選擇性優勢。

4 微衛星在釀酒酵母親緣關系確定方面的應用

Mercado等[32]連續兩年從ZARM產區的酒廠設備和馬爾貝克葡萄汁的自然發酵過程中采樣，從所分離釀酒酵母中選擇出28個代表菌株，連同來自法國的7株商業酵母，通過interdelta分型、mtDNA限制分析和微衛星PCR 3種方法考察它們之間的親緣關系。3種方法結合分析，可準確區分34株釀酒酵母。研究結果顯示，一些菌株其來源雖相同，但分子關系復雜，系統發生樹也會隨分析方法的不同存在差異；同時，根據不同的研究目的選擇不同分析方法的重要性和必要性。Malgoire等[33]對來自法國醫學中心的69株釀酒酵母和8個參考菌株(5株釀酒酵母，3株布拉酵母)進行親緣關系分析，共選擇5個微衛星位點，得到34個等位基因，64種電泳類型，并對其結構進行因子對應分析，結果聚為3類，類群Ⅰ只包含臨床菌株，類群Ⅱ包含釀酒酵母參考菌株，類群Ⅲ則由布拉酵母參考菌株構成。他評價微衛星可揭示臨床釀酒酵母菌株高度多樣性，是研究酵母親菌株緣關系的有力工具。

5 微衛星在釀酒酵母群體研究中的應用

Schuller等[27]在2001—2003年間從葡萄牙3個葡萄園分離得到1260個釀酒酵母單菌落，經過mtDNA-RFLP初步分型，得到361個不同類群，隨后對其6個高多態微衛星位點進行分析，共得到93個等位基因，其中52個首次被報道。假設所選位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態，經計算，6個位點雜合度觀測值(observed heterozygosity，Ho)均低于期望值(expected heterozygosity，He)3～4倍，暗示供試群體的無性繁殖及子結構化。此外，3個葡萄園釀酒酵母群體間的遺傳差異表現為等位基因頻率的不同。該研究第一次使用微衛星分型技術對大量本土釀酒酵母菌株進行生態研究，為釀酒酵母菌株生態學和生物地理學研究奠定基礎，也為生物多樣性和遺傳資源的保護提供依據。Pereira等[34]曾累計4a(2001—2003年， 2006年)從5個產區(Estremadura、Palmela、 Alentejo、Vinho Verde、Bairrada)20個葡萄園和9個葡萄品種分離得到4470個釀酒酵母菌株單菌落。通過mtDNA-RFLP和interdelta-PCR結合分析后得到502個類群，從每個類群各選擇一株釀酒酵母作為代表菌株，進行10個位點的微衛星PCR，得到192個等位基因，計算亞群間(這里指來自不同產區的類群)的遺傳分化程度指標(Fst)和等位基因頻率相似矩陣，并基于此構建不同亞群的系統樹。結果顯示，釀酒酵母群體的遺傳差異主要來自特定葡萄園特異等位基因的差異及10個位點等位基因頻率微小差異的積累，這些差異可用于鑒定群體結構；4個年份中，同一個葡萄園均分離出相同或類似的釀酒酵母菌株，暗示每個葡萄園都有其不同于其他葡萄園的酵母群體，且特異性本土酵母的出現可能與風土有關。

工業生產中形形色色的發酵產品背后隱藏著釀酒酵母菌株迷人的遺傳多樣性，保護酵母多樣性的核心內容就是保護酵母的遺傳多樣性。微衛星技術可揭示菌株地理起源和遺傳特征之間的關系、兩兩菌株之間的關系及釀酒酵母群體之間的關系，是分析釀酒酵母多樣性的有力工具。隨著微衛星序列搜索技術、引物開發技術和檢測分析技術的不斷完善，微衛星標記將會在釀酒酵母研究中表現出更強的生命力，為本土釀酒酵母菌株遺傳多樣性的保護和開發提供更大便利，為釀酒酵母群體生態學研究開拓更多視角。

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