節節草多糖的體外抗氧化活性

張俊生，陳莉華*，朱士龍，吳孝濤，肖 斌

(吉首大學化學化工學院，湖南 吉首 416000)

節節草為木賊科多年生草本植物，在《中國藥典》2010版中學名為木賊[1]，含黃酮[2]、生物堿[3]、植物多糖及有機硅等活性成分。節節草藥用歷史悠久，已有報道證實其具有降血脂、保護血管內皮細胞、降低炎性因子分泌等效應[4-6]。天然多糖由于具有抗氧化、防衰老、抗腫瘤、降血糖等生物活性在食品和藥品開發與利用方面已引起廣泛關注。從常見的植物食品如黃瓜[7]、蘆筍[8]、 野艾蒿[9]提取純化多糖的研究不斷見諸報道。國內外目前已報道了200 多種天然多糖[10]，其中95%以上為植物多糖，充分利用植物多糖的天然無毒性開發各種功能性食品和保健品滿足了人類對天然產品的渴望。

本實驗以節節草為原料，采用超聲波輔助提取多糖，探討節節草多糖粗品和多糖純品的體外抗氧化活性，并與VC進行對比，以期為節節草資源的合理利用及進一步開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

節節草采于吉首本地，經吉首大學資環學院植物學教研室鑒定確認。動物油為市售新鮮豬板油熬制而成，金健牌茶籽油(植物油)購于吉首本地超市。

苯酚、沒食子酸、VC、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、冰醋酸、淀粉、KI、H2SO4、CHCl3、I2等均為分析純。

1.2 儀器與設備

KQ250-E型超聲波清洗器、SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵、K-201B-Ⅱ旋轉蒸發器 鄭州長城科工貿有限公司；GZX-9070MBE數顯鼓風干燥箱 上海基瑋試驗儀器設備有限公司；723可見分光光度計 上海荊和分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 節節草多糖的提取純化及含量測定

稱取一定量節節草粉末，按料液比1：10(m/V)加入蒸餾水，在溫度60℃、功率250W條件下超聲波提取40min，提取3次后合并濾液，減壓濃縮，濃縮液加入3倍量95%乙醇，醇沉兩次，將沉淀離心，用乙醚除脂質2次，Sevag法除蛋白質3次，再次離心收集上清液，即得到節節草多糖粗品溶液，將多糖粗品溶液以液料比10：1(V(多糖粗品)：m(樹脂))過D-101樹脂柱，0.2mol/L的NaCl溶液進行洗脫，收集洗脫液，得到節節草多糖純品溶液。

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[7-9]。以葡萄糖為對照品，波長490nm處測得吸光度(A)與葡萄糖質量濃度(ρ)之間的回歸方程為：A=0.0055ρ－0.0053(R2=0.9998)，線性范圍：10～100μg/mL。多糖粗品溶液多糖含量8.42%，多糖純品溶液多糖含量30.57%。

1.3.2 節節草多糖提取液清除·OH作用測定

建立Fenton反應體系模型[7-9]。取2mmol/L FeSO4溶液3mL于比色管中，加入1mmol/L H2O2溶液3mL，再加入6mmol/L水楊酸溶液3mL，立即搖勻，37℃水浴下加熱15min后取出，然后加入1.0mL提取液，繼續水浴加熱15min，以空白液為參比在波長510nm處測其吸光度AX。取1.0mL蒸餾水代替提取液按照以上方法進行檢測，37℃水浴恒溫15min后測得其吸光度A0，重復3次。以相同質量濃度VC溶液作對比，按式(1)計算樣品對·OH的清除率。

式中：A0為空白對照液吸光度；Ax為待測樣品液吸光度；Ax0為本底吸光度。

1.3.3 節節草多糖提取液清除O2－·作用測定

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產生穩定的O2－·并生成有色中間產物，可通過比色法檢測[7-9]。取pH8.2的50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液4.5mL和1.0mL樣品提取液，混勻，室溫條件下放置4min，325nm波長處測定樣品吸光度(Aj)。再取Tris-HCl緩沖溶液4.5mL和7mmol/L鄰苯三酚3.0mL，混勻，室溫條件下放置4min，325nm波長測其吸光度(A0)。依上法，取Tris-HCl緩沖溶液4.5mL和1.0mL樣品提取液，混勻后在室溫條件下放置4min，加入3.0mL鄰苯三酚，計時，5min后于波長325nm處測定體系的吸光度(A)。以相同質量濃度VC溶液作對比，計算樣品對O2－·清除率。

式中：A為樣品加入緩沖溶液及鄰苯三酚后的吸光度；Aj為樣品加入緩沖溶液后的吸光度；A0為緩沖溶液加入鄰苯三酚后的吸光度。

1.3.4 節節草多糖提取液對NO2－清除作用的測定

NO2－在酸性條件下與對氨基苯磺酸發生反應，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色絡合物，該絡合物在波長538nm處有最大吸收，因此，可用分光光度法間接測定NO2－的量。

標準曲線繪制：精密吸取10μg/mL亞硝酸鈉溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于50mL容量瓶中，分別加入4g/L的對氨基苯磺酸溶液2.0mL，混勻，靜置5min，再加入2g/L的鹽酸萘乙二胺溶液1mL，加水至刻度，混勻，靜置15min。在波長538nm處測定吸光度，得標準曲線：A=0.3969ρ+0.0403(R2=0.9969)，NO2－在0～0.2μg/mL之間有良好的線性關系。

吸取1mL樣品液，加入10μg/mL的亞硝酸鈉溶液1.0mL，以相同質量濃度VC溶液作對比，按照標準曲線方法計算NO2－量及樣品對NO2－的清除率。

式中：ρ為未加多糖提取液前由標準曲線計算得到的NO2－的量/(μg/mL)；ρ0為加入多糖提取液后由標準曲線計算得到的NO2－的量/(μg/mL)。

1.3.5 節節草多糖提取液抗油脂氧化實驗

參照文獻[1 1]繪制標準曲線并求出碘量-吸光度之間的數學關系。碘量(M，μmol)與吸光度A在0 ～0.96 μmol 間有良好的線性關系，回歸方程為M=4.0153A+0.0039(R2=0.9986)。

多糖提取液對油脂的抗氧化性采用國際上通用的烘箱強化貯存法：稱取20g油脂，加入2mL提取物，攪拌均勻后，放入烘箱中強化保存，間隔1h交換在烘箱中的位置并取1mL待測樣品，參照標準曲線方法分別測定波長585nm處的吸光度。以同質量濃度VC溶液作對比，比較其抗氧化能力。按式(4)計算油脂過氧化值(POV)及多糖對油脂的氧化抑制率(η)。

式中：M表示碘生成量/mmol；m表示油脂質量/kg。

式中：POV初為未對油脂進行強化氧化時的過氧化值/(mmol/kg)；POV末1為添加多糖的油脂強化氧化后的過氧化值/(mmol/kg)；POV末2為未添加多糖的油脂強化氧化后的過氧化值/(mmol/kg)。

取相同質量濃度的節節草多糖溶液加入到20g植物油和豬油中，充分攪拌后，分別置于40、50、60℃烘箱內，間隔1h取樣檢測。

2 結果與分析

2.1 節節草多糖質量濃度對清除·OH的影響

圖 1 多糖質量濃度對·OH清除率的影響Fig.1 Concentration-dependent scavenging activity of crude and purifi ed polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. against ·OH

由圖1可知，節節草多糖粗品、純化品清除·OH的作用均比較明顯；在質量濃度0～0.9mg/mL范圍內，隨著兩種多糖質量濃度的增大，清除率逐漸升高，但均低于VC的清除率；此外，節節草粗多糖對·OH的清除率均較純化多糖高。總體而言，對·OH清除率的大小排序為：VC＞節節草多糖粗品＞節節草多糖純化品。

2.2 節節草多糖質量濃度對清除O2－·的影響

圖 2 多糖質量濃度對O－2·清除率的影響Fig.2 Concentration-dependent scavenging activity of crude and purif eid polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. against O2－·

由圖2可知，在實驗所選取質量濃度范圍內，兩種節節草多糖對O2－·的清除率具有相同趨勢，都是隨著多糖質量濃度的增大而升高，節節草多糖粗品的清除率略好于多糖純化品，但明顯都較VC的清除率低。

2.3 節節草多糖質量濃度對清除NO2－的影響

圖 3 多糖質量濃度對NO2－清除率的影響Fig.3 Concentration-dependent scavenging activity of crude and purifi ed polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. against NO2－

由圖3可知，隨著多糖質量濃度的增大，3種溶液對NO2－的清除率均呈上升趨勢，且VC對NO2－的清除率最高。在質量濃度為0.23mg/mL時，VC對NO2－的清除率已大于97.5%，質量濃度大于0.3mg/mL后，清除率上升不明顯，基本穩定在98%左右。多糖粗品、多糖純化品對NO2－的清除率也隨質量濃度的升高而增大，但在實驗質量濃度范圍內，多糖粗品清除率均好于多糖純化品。

2.4 節節草多糖對·OH、O－2·及NO2－清除能力比較

由表1、2可知，節節草多糖粗品、多糖純化品均對·OH、O2－·及NO2－有很好的清除作用，相同質量濃度下，兩種多糖的清除能力為：NO2－＞O2－·＞·OH，但多糖粗品清除率均高于多糖純化品。

表 1 不同質量濃度的多糖粗品對·OH、O－2·及NO2－的清除率Table 1 Scavenging activity of crude polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. at different concentrations against ·OH, O2－· and NO2－%

表 2 不同質量濃度的多糖純化品對OH、O2- 及NO2- 的清除率Table 2 Scavenging activity of purififi ed polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. at different concentrations against OH, O2-and NO2- %

一般來說，植物多糖的活性與其分子質量、溶解度、黏度和化學結構有關[12]。富硒花生中的粗多糖相對于純化多糖，具有更長的誘導時間、更高的DPPH自由基清除能力和更高的還原力[13]，對蟲草與富硒蟲草多糖的體外抗氧化活性研究表明，蟲草多糖對O2－·和H2O2的清除能力依次為富硒蟲草胞外多糖＞富硒蟲草胞內多糖＞蟲草胞外多糖＞蟲草胞內多糖，而對·OH的清除能力依次為：富硒蟲草胞外多糖＞蟲草胞外多糖＞富硒蟲草胞內多糖＞蟲草胞內多糖[14]。多糖的活性還與共存的植物蛋白有關，對娑羅子多糖的生物活性研究表明，對·OH、H2O2和DPPH自由基的清除作用，粗多糖的活性強于去蛋白多糖[15]。本研究結果也表明，節節草中的多糖粗品比去蛋白后的多糖純化品具有更好的清除·OH、O2－·、NO2－的能力。

2.5 多糖對油脂的抗氧化活性

2.5.1 溫度對多糖抗油脂氧化效果的影響

由圖4可知，在測定節節草多糖粗品對植物油氧化抑制率的過程中，溫度對測定結果的影響很大。3種溫度條件下，多糖對植物油氧化抑制率均隨時間的延長先增大后又降低。此外，40～50℃時，隨著溫度的升高，多糖的氧化抑制率也不斷升高，但溫度升高至60℃時，多糖對油樣的氧化抑制率反而下降。產生這種現象的原因可能是在加熱條件下，引發了植物油發生了自氧化反應，同時溫度較高使多糖的熱穩定性降低，造成抗氧化劑對植物油的氧化抑制率降低。

同樣，節節草多糖粗品對動物油氧化抑制與對植物油的抑制效果相似，均是隨著溫度的升高，抑制率先上升后下降，比較圖4a和圖4b可以明顯看出：節節草多糖粗品對植物油的氧化抑制率隨溫度的變化更為明顯，在相同條件下，節節草多糖粗品對植物油氧化抑制效果大于對動物油的氧化抑制效果。

圖 4 溫度對多糖抑制油脂氧化的影響Fig.4 Infl uence of temperature on anti-lipid oxidation activity of crude polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf.

2.5.2 多糖純化前后對油脂的抗氧化性比較

分別比較了VC、節節草多糖粗品、純化品對植物油和動物油的抗氧化效果。分別在20g植物油和豬油中加入質量濃度均為0.5mg/mL的節節草多糖粗品溶液、多糖純品溶液及VC溶液2mL，混合均勻后，分別置于40℃烘箱內，每隔1h取樣檢測，結果見表3、4。

表 3 多糖純化前后對植物油氧化抑制率比較Table 3 Antioxygen on antioxidation activity of polysaccharide to vegetable oil %

表 4 多糖純化前后對動物油氧化抑制率比較Table 4 Antioxygen on antioxidation activity of polysaccharide to fat%

由表3、4可知，相同質量濃度條件下，節節草多糖粗品、多糖純化品對植物油和豬油均有較好的抗氧化效果，對動物油來說，節節草多糖粗品抗氧化效果明顯弱于多糖純化品，而對植物油來說，卻無顯著差別，但兩者均不及VC的抗氧化作用，在烘箱放置時間變化很大時，多糖粗品對油樣的抑制率變化并不大，而多糖純化品對油樣的抑制率變化比較大。

3 結 論

節節草多糖粗品及純化品的體外抗氧化結果表明，二者在一定質量濃度范圍內對·OH、O2－·及NO2－均有一定的清除作用，且清除效果與多糖質量濃度有劑量效應關系。

在清除·OH、O2－·及NO2－時，相同質量濃度條件下節節草多糖純化品的清除效果均弱于同質量濃度的多糖粗品，這是因為植物多糖的活性與其不僅與其分子質量、溶解度、黏度和化學結構有關，而且與共存的植物蛋白也有關系，在清除自由基方面，含植物蛋白的粗多糖往往比純化多糖效果更好。

節節草多糖粗品及純化品對植物油及動物油均有一定的抗氧化效果，總體而言，多糖粗品對植物油氧化抑制率大于對動物油氧化抑制率，但受溫度、時間的影響變化較大。

節節草多糖具有良好的抗氧化能力，原料來源廣，提取工藝簡單，作為一種新的天然、保健的綠色食品抗氧化劑應有良好的開發前景。

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