低溫條件下冷卻豬肉中假單胞菌生長模型的比較分析

牛會敏，李苗云*，趙改名，張秋會，田 瑋，黃現青，柳艷霞，張建威，高曉平，孫靈霞

(河南省肉制品加工與質量安全控制重點實驗室，河南農業大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002)

近年來，冷卻豬肉逐漸發展成為我國生鮮肉消費的主流，國內外關于冷卻豬肉中假單胞菌生長預測模型已經做了大量研究[1-4]。在預測微生物學領域，修正的Gompertz、Baranyi、Logistic及Huang等初級模型常被用來描述微生物數量隨時間的變化關系，在已有的研究中，大都選用單一的模型來描述假單胞菌數量隨時間變化的函數關系。盡管很多不同的非線性方程被當做模型用來預測微生物的生長，但并不能確定哪一種模型可以在本質上更優于其他模型[5]。在模型選擇上很多學者做出了相當多得努力，一些比較研究文獻也有報道[6-9]，然而有必要直接采用以實際食品為培氧基質而培養的微生物數據來評價常用初級模型的統計擬合能力。

本實驗選擇3種常用的初級模型來擬合由冷卻豬肉復雜微生物體系中直接測定的假單胞菌生長數據，用殘差值分布圖及殘差平方和(residual sum of squares，RSS)，殘差標準誤(residual standard error，RSE)及赤池信息量準則(akaike information criterion，AIC)等統計指標來綜合比較分析3種模型擬合托盤包裝冷卻豬肉中假單胞菌生長的情況，為冷卻豬肉假單胞菌預測預報體系模型選擇提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷卻豬肉豬背最長肌 河南漯河雙匯集團。

假單胞菌瓊脂(CM0559、SR0103E，PE真空包裝袋) 英國Oxoid公司。

1.2 儀器與設備

HVE-50壓力蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司；SPX-1505H-Ⅱ生化培養箱 上海新苗醫療器械公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；MIR-254 低溫恒溫培養箱 日本Sanyo公司；VORTEX-2 GENIE 渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 取樣及貯藏

從雙匯集團分割生產線隨即采取豬背最長肌，用保鮮膜包裹，放置裝有冰袋的保溫箱中，迅速轉運至實驗室。修去筋腱后，將肉無菌切成小塊，按質量稱取每袋220g左右進行真空包裝，在0、5、10℃條件下貯藏。貯藏在0℃條件下的冷卻豬肉，每隔48h取樣測定假單胞菌；5℃貯藏的樣品每隔24h取樣測定；10℃貯藏的樣品每隔12h取樣測定。

1.3.2 冷卻豬肉中假單胞菌的計數方法

無菌操作稱取25g樣品，用剪刀剪碎后置于裝有225mL的8.5%滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，取100μL按1：10進行倍比稀釋，之后按照修改的6×6點樣法[10]進行微生物測定。每組樣品做5次平行。

1.3.3 微生物生長動力學模型

在預測微生物學領域，預測模型是按數學模型進行分類的，初級模型表征的就是在一定生長環境和條件下微生物數量隨時間變化的關系。選擇3種常用的初級模型來擬合低溫條件下冷卻豬肉中假單胞菌的生長數據。

修正的Gompertz模型是經驗模型，最初不是設計用來描述微生物生長，只是模型中的參數被賦予了物理含義來解釋微生物的生長參數，而這些參數在建立和解釋模型時都發揮了重要作用，此模型因使用簡單而被廣泛應用于預測微生物的生長。為了直接與另外兩個生物學基礎的模型進行比較，本實驗用自然對數值取代常用對數值，修正的Gompertz模型直接表述為：

式中：Y是t時微生物的自然對數值(ln(CFU/g))；Nmax和N0分別是Y的初始值、最大值；μG是在時間M時的相對最大生長速率；M是達到相對最大生長速率所需要的時間。恒溫條件下遲滯期λ和生長速率K可根據公式(2)、(3)計算。

由Baranyi等[11]在1994年提出的Baranyi模型得到了越來越廣泛的應用，其最大的優點就是擬合性較高，并且使用方便；動態環境也可以使用；適合多種情況；模型中的參數都具有生理學意義，是真正意義上的動力學模型。其方程描述如下。

式中：N0和ymax分別是Y的初始值、最大值；K是生長速率。

遲滯期的計算根據公式(5)，參數h0只是使曲線擬合更適宜的原始數據的一個中間轉換[12]。

最后選擇的是Huang模型[13]，該模型來源于恒溫條件下微生物生長情況的3個階段(遲滯期、對數期、穩定期)，公式可以描述為式(6)、(7)。

公式中參數的生物學意義同Baranyi模型。

1.4 數據分析

采用Excel分別計算每個樣品假單胞菌數取對數值后的平均值[平均lg()][14]，每個樣品假單胞菌取平均值后的對數值(N)，假單胞菌平均值的估計值(lgA)。

式中：k為lg菌落數；s為標準差。

采用SAS的統計軟件對假單胞菌的生長數據進行非線性回歸擬合。目前，并沒有一個單獨并簡單的統計方法來評價非線性模型之間的異同及如何優先選擇一個模型這個問題。一般情況下，主要選擇殘差分析和擬合度等統計標準來評價不同非線性模型之間的比較，從而綜合評價模型的整體擬合能力[15]。本實驗用殘差分析、RSS、RSE及AIC來整體評價3種模型的擬合能力。RSS和RSE值越小，模型擬合效果越好。采用Excel軟件對擬合的生長曲線進行繪圖。

式中：n為實驗數據的總數；p為模型中參數的個數；RSS為殘差平方和；n為數據的總數；m為模型中參數的個數。AIC是衡量統計模型擬合優良性的一種標準，在不同的溫度條件下對實驗數據進行擬合，AIC值最小的模型是最準確的[16]。

2 結果與分析

2.1 低溫條件下冷卻豬肉中假單胞菌的生長特點

假單胞菌屬是嗜冷菌，一直被認為是在有氧條件下引起冷卻肉腐敗的主導作用菌[17-18]。由圖1可知，3組溫度下假單胞菌的初始菌值分別是11.81(ln(CFU/g))、8.65(ln(CFU/g))和9.25(ln(CFU/g))，從遲滯期的細節圖2可以明顯看出，托盤包裝冷卻豬肉中假單胞菌在低溫條件下(0、5、10℃)出現明顯的菌數下降趨勢，隨后呈現典型“S”形生長。可能是樣品經歷了從企業到實驗室的溫度波動歷程后，低溫貯藏抑制了假單胞菌的生長，導致假單胞菌數量的下降。另外，假單胞菌是冷卻豬肉屠宰過程中污染的微生物，在豬肉這種新環境適應過程中，細胞由于不適應新環境生長導致了死亡速率大于生長速率，從而出現了初始假單胞菌數量下降的趨勢[19]。

圖 1 0(a)、5(b)、10℃(c)條件下冷卻豬肉中假單胞菌觀測值及擬合曲線Fig.1 Growth fitting curves of Pseudomonas in chilled pork at 0(a), 5 ℃(b) and 10 ℃(c)

圖 2 0(a)、5(b)、10℃(c)條件下冷卻豬肉中假單胞菌遲滯期細節圖Fig.2 lg phase of Pseudomonas in chilled pork at 0(a), 5 ℃(b) and 10 ℃(c)

2.2 3種模型統計指標的比較分析

2.2.1 殘差分布的分析

圖 3 0(a)、5(b)、10℃(c)條件下3種模型擬合的冷卻豬肉中假單胞菌數據的相對殘差值分布圖Fig.3 Distribution of relative residuals for three kinetics models for Pseudomonas growth in chilled pork at 0(a), 5 ℃(b) and 10 ℃(c)

由圖3可知，在0℃條件下，3種模型的殘差值均圍繞殘差等于零的直線上下隨即分布，這說明回歸曲線對原觀測值的擬合情況良好。而相對于修正的Gompertz和Huang模型來說，Baranyi模型擬合的殘差值分布更集中，在±0.3的范圍內波動，說明在0℃條件下，Baranyi模型能更準確地預測冷卻豬肉中假單胞菌的生長狀況。在5℃條件下，修正的Gompertz模型擬合的殘差值分布相對集中，在殘差值等于零的直線上下隨即分布，范圍波動在±0.4以內，說明在此溫度下，修正的Gompertz模型能更準確的預測冷卻豬肉中假單胞菌的生長情況。同樣的分析在10℃條件下，Huang模型是預測假單胞菌生長最準確的選擇。

2.2.2 擬合度統計指標的分析

表1反映的是低溫條件下3種模型擬合的統計指標的比較分析。可以看出，在0℃條件下，Baranyi模型擬合的RSS、AIC和RSE值是最小的，5℃條件下修正的Gompertz模型擬合的RSS、AIC和RSE值是最小的，而10℃條件下，擬合出最小RSS、AIC和RSE值的卻是Huang模型，3種模型中的任何一個模型都不能同時對所有溫度下的實驗數據表現出最佳的擬合能力。Baty等[20]在5～42℃范圍內的不同條件下，比較了修正的Gompertz、Baranyi和Lag-exponential模型對15個數據庫里關于混合大腸桿菌O157：H7菌株生長數據的擬合情況，得出沒有一個模型可以對所有的數據表現出持續的最佳擬合能力。

表 1 3種模型擬合的各項統計指標的比較分析Table 1 Comparative analysis of statistical parameters obtained from three growth models

目前國內外報道的研究中大多是采用單一的某一個模型對微生物進行預測，如楊紅菊[21]、何帆[22]等均選用修正的Gompertz函數對不同包裝方式冷卻豬肉中的假單胞菌建立了動力學生長預測模型；Sivila[23]、Radovan[24]等使用Baranyi模型分別建立了有氧條件下生鮮禽肉中假單胞菌的生長預測模型。Koutsoumanis等[25]結合溫度和pH值的影響使用Baranyi分別建立了豬肉和牛肉中假單胞菌的生長預測模型。

對于建立微生物預測模型的數據收集來說，用液體培養基培養與實際肉品不同，肉湯培養基體系穩定，不考慮原料組織對微生物的影響，大都采用確定的某一個模型進行建模；而實際肉品中微生物生長體系復雜，通過自然污染的原料肉直接測定的數據考慮了肉中復雜的微生物生長環境，能更真實的反映微生物的生長情況，因此有必要研究此環境下的微生物生長預測模型。

目前肉中假單胞菌的生長大都單獨采用單一的模型進行預測，對于冷卻豬肉來說，不同溫度下哪種模型更適用于預測假單胞菌的生長并不清楚。本實驗直接以托盤包裝的冷卻豬肉作為研究對象，假單胞菌出現初始菌值下降趨勢的特點；選用不同的模型對數據進行擬合，找出了不同溫度下預測假單胞菌生長的最適模型，Baranyi模型是0℃最適的，而5℃和10℃條件下的最適模型分別是修正的Gompertz和Huang模型。因此，通過以上分析和討論可知，對于復雜的肉品體系而言，不同的溫度條件下應該選擇最適合的模型而不是單一的模型來預測假單胞菌的生長，這也為冷卻豬肉實際生產中建立假單胞菌的預測預報體系提供了理論依據。

3 結 論

低溫條件下，托盤包裝冷卻豬肉中假單胞菌數量在遲滯期出現初始菌值下降的趨勢。在0、5、10℃條件下擬合冷卻豬肉中假單胞菌生長的最適模型分別是Baranyi、修正的Gompertz和Huang模型。在對冷卻豬肉中假單胞菌進行預測時，不同的溫度條件下應該選擇最適合的模型而不是單一的模型來預測假單胞菌的生長。

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