新型生物防腐劑——多聚陽離子抗菌肽在畢赤酵母中的表達

李 青，周曉宏

(北京理工大學生命學院，北京 100081)

食品防腐劑在食品的生產、運輸和貯存過程中對防止食品腐敗、保障食品質量具有非常重要的作用。我國目前食品生產中使用的防腐劑絕大多數都是人工合成的，然而長時間的攝入，可能存在潛在的食品安全隱患；另一方面，濫用非食用物質或超量超范圍使用食品防腐劑用于食品防腐的現象還時有發生，引起了嚴重的食品安全事件。解決食品安全問題除了制定嚴格的政策法規和加強食品安全監管之外，開發天然、安全、高效、耐熱的食品防腐劑是解決我國食品安全的重要舉措。

抗菌肽是生物體內經誘導產生的一種具有抗菌活性的小分子多肽，多數具有堿性、帶正電荷、抑菌效率高的特點，是構成宿主防御細菌、真菌等入侵的重要分子屏障[1-2]。1975年Boman等[3]從注射了大腸桿菌的美國天蠶蛹中分離得到了被命名為天蠶素(cecropins)的抗菌活性肽，同時還完成了這種抗菌肽的氨基酸序列測定，自此揭開了人們對抗菌肽研究的序幕。目前大多數抗菌肽應用于醫藥領域，而用于食品防腐劑領域的只有乳酸鏈球菌素和ε-多聚賴氨酸。乳酸鏈菌素存在不耐熱的問題，且對G－菌抑菌效果不佳；多聚賴氨酸不能被胃腸道消化，進入腸道可能會抑制腸道中的正常菌群。前者屬于兩親型陽離子抗菌肽，而后者屬于單一陽離子抗菌肽。由于兩者均作用于帶負電荷的細菌磷脂雙分子層細胞膜保守結構，因而細菌很難通過改變細胞膜的結構而產生抗性[4-5]。多聚陽離子抗菌肽的抑菌作用不依賴于空間三維結構，具有很強的耐熱性，對G+菌和G－菌都有較好的抑菌作用，具有廣譜性[6]。單一陽離子抗菌肽主要由多聚堿性必需氨基酸賴氨酸和精氨酸以及半必需氨基酸組氨酸組成，如果合成由堿性氨基酸通過α-氨基連接而成的多肽，則進入人體消化道后可被胰蛋白酶解形成必需與半必需氨基酸，還具有營養作用。因此，合成由精氨酸、賴氨酸、組氨酸3種堿性氨基酸組成的新型的α-多聚陽離子抗菌肽用于食品防腐，將具有耐熱、高效、廣譜、不易耐藥、營養、天然和安全的特點。

目前國內外已有采用基因工程的方法制備兩親型抗菌肽的報道[7-8]，由于抗菌肽通常帶有陽離子正電荷，與帶有陰離子的DNA可能發生相互作用，具有一定的細胞毒性，因此通常采用融合蛋白的形式進行表達[9-10]。這些相關報道主要側重于基礎研究或制藥技術開發，沒有單一的α-多聚陽離子抗菌肽食品防腐劑基因工程技術的研究報道。由于大腸桿菌不是食品安全菌，所以采用畢赤酵母Pichia pastoris表達體系對單一的多聚陽離子抗菌肽進行表達。畢赤酵母表達系統作為一種真核的表達系統，具有乙醇氧化酶AOX1基因啟動子，這是目前最強、調控機理最嚴格的啟動子之一[11-12]，一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體復制而復制，不易丟失，所以外源蛋白基因遺傳穩定，操作也較為簡單。

本研究通過人工合成多聚陽離子肽與多聚陰離子肽融合基因，轉化畢赤酵母，表達抗菌肽融合肽，并采用胃蛋白酶拆分，使融合肽多聚陽離子肽與多聚陰離子肽分離，為生產新型食品生物防腐劑多聚陽離子抗菌肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

畢赤酵母GS115菌株 美國Invitrogen公司；枯草芽孢桿菌，為本實驗室分離自腐敗變質肉類。

YPD培養基：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L；BMGY培養基：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、磷酸鹽緩沖液100mmol/L、YNB 13.4g/L、生物素4×10-5g/L、甘油10g/L，pH 6.0；BMMY培養基：5g/L過濾除菌的甲醇替代BMGY的10g/L甘油。最小葡萄糖(minimum dextrose，MD)平板：YNB 13.4g/L、生物素4×10-5g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂粉15g/L。培養基的配制方法參考美國Invitrogen公司的Easyselect Pichia Expression Kit說明書。

1.2 試劑

E. coli DH5α、質粒pPIC9基因序列及引物，由美國Invitrogen公司合成，1kb DNA Marker和 DNA Marker Ⅶ北京莊盟生物基因科技公司；超低分子質量蛋白Marker北京索萊寶科技公司；Taq酶 日本TaKaRa公司；限制性內切酶SalⅠ 美國NEB公司；Tricine、山梨醇 美國Sigma公司；質粒提取試劑盒 百泰克公司；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 融合肽基因合成

設計一段60個氨基酸殘基的融合肽，N端為酸性氨基酸，C端為堿性氨基酸，中間設置了胃蛋白酶酶切位點疏水性氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)，增加酸性多肽序列是為了中和堿性多肽序列，以免表達后產生細胞毒性。序列如下：EDEDQESEDNDESEEDDDEEDEDDQEDEDFYR RHRRKHRRRKKHRRKKHRRRKHHRKHRR。

根據畢赤酵母密碼子偏好性[13]，設計這60個氨基酸融合肽的基因序列：5’-GAAGAUGAGGACCAGGAGUC CGAAGACAAUGAUGAAUCUGAGGAGGACGAUGACGAAGAAGAUGAAGACGAUCAAGAGGAUGAGGACU UCUACAGAAGGCAUAGACGUAAGCAUCGUAGACG UAAGAAGCAUAGACGUAAGAAACAUAGGAGGCGC AAGCACCACAGAAAGCACAGACGU-3’，其中N端為酸性氨基酸，C端為堿性氨基酸。

對所需合成的目的基因全序列進行分析，檢查基因內部有無特別復雜二級結構和重復序列，將序列提交美國Invitrogen公司合成。

首先根據基因序列分析的結果，分別進行單鏈Oligo的設計及合成，然后利用PCR將合成的Oligo拼接目的基因片段。PCR產物凝膠電泳，割膠回收約180bp目的條帶。將上一步回收好的片段連接入pMD-18T載體16℃連接1h將連接產物轉化至感受態細胞DH5α。挑取平板上的單克隆接種于4mL氨芐LB培養基中，37℃搖床過夜培養；質粒抽提后測序驗證。

1.3.2 構建重組表達質粒載體

根據目的基因序列，設計1對PCR擴增引物，并在序列的5’端添加限制性酶切位點EcoRⅠ(GAATTC)，在序列的3’端添加NotⅠ位點(GCGGCCGC)，為了保證密碼框的正確，加入保護堿基。引物：P1：5’-CCGGAATTCG AAGATGAGGACCAGGAGTCCG-3’，P2：5’-ATAAGA ATGCGGCCGCACGTCTGTGCTTTCTGTGGTGC-3’。

電泳回收約200bp條帶；用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切回收的目的片段，37℃酶切1h后過柱回收。用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切pPIC9載體37℃酶切2h后電泳回收；連接酶切后片段及載體，16℃連接1h后轉化到E. coli DH5α感受態細胞。

將含有質粒的E. coli DH5α按1%接種到10mL LB液體培養基(含50μg/mL Amp)中，37℃振蕩培養約12h至對數生長后期。提取質粒，0.8%瓊脂糖電泳。測序驗證重組克隆中插入片段的序列信息。

1.3.3 畢赤酵母GS115生長曲線測定

挑取GS115單菌落，接種在含有5mL YPD液體培養基中，30℃、170r/min振蕩過夜。取100μL培養物接種至含有100mL YPD培養基的250mL三角搖瓶中，30℃、170r/min培養，每隔2h取樣測定菌液OD600nm值，繪制畢赤酵母生長曲線。取不同生長時期的酵母細胞用于下述感受態細胞的制備及電轉化。

1.3.4 畢赤酵母GS115感受態制備

取不同生長時期的酵母菌液轉入50mL離心管，4℃、1500×g離心5min，棄上清；50mL冰預冷無菌水重懸，4℃、1500×g離心5min，棄上清；25mL冰預冷無菌水重懸，4℃、1500×g離心5min，棄上清；5mL 1mol/L冰預冷山梨醇重懸，4℃、1500×g離心5min，棄上清；約400～500μL 1mol/L冰預冷山梨醇重懸，每管80～100μL分裝，感受態細胞保存在－20℃冰箱，大約1周內可用[14]。

1.3.5 目的基因電擊轉化GS115

取10μL經SalⅠ單酶切處理的重組質粒溶解在5～10μL TE溶液中，與80μL GS115感受態細胞混合，轉入0.2cm冰預冷電擊杯中，冰浴5min。在1.5kV，電容25μF，5ms，電阻200Ω條件下進行電轉。電擊后立刻加入1mL 1mol/L冰預山梨醇，將內容物轉入滅菌離心管中。分成200μL等份，涂于MD平板上，30℃倒置培養，直至得到單個菌落生長。

1.3.6 菌落PCR篩選陽性重組子

當平板上的菌落長到肉眼可見時，挑取單菌落于無菌EP管中，加入100mg/mL蝸牛酶50μL，37℃水浴反應1h破壁，離心取上清作為模板，用酵母5’AOX和3’AOX通用引物對各個菌落進行PCR擴增。PCR反應參數如下：94℃變性10min；94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸反應2min，重復30個循環；72℃延伸10min。反應完畢后取10μL上樣電泳。對于顯現特異性條帶的克隆，重新培養并保存。

1.3.7 目標蛋白的誘導表達

將篩選出的重組菌株接種于YPD培養基，28℃、170r/min振蕩培養過夜。涂布YPD平板活化，28℃培養至長出單菌落。挑取一活化的單菌落接種到250mL BMGY培養基中(初始pH6)，28℃、170r/min搖床培養16～18h，至其OD600nm值在2.0～6.0之間。4℃、9000×g離心10min收集菌體，用無菌超純水洗滌菌體1～2次。用50mL BMMY重懸菌體，將所得菌液置于250mL擋板瓶中，雙層紗布封口，于28℃、170r/min振蕩培養。每24h向培養基中添加甲醇至終體積分數為0.5%；同時補充滅菌超純水，使菌液總體積保持不變。按時間點分別取菌液樣品，取樣量為1mL，置于1.5mL EP管中，4℃、9000×g離心2～3min，收集上清，分析目的蛋白的表達量和菌液最佳收獲時間。時間節點取：0、24、48、72、96h。Tricine-SDS-PAGE分析表達產物。凝膠的配制方法、電泳條件和染色方法參照文獻[15]。

1.3.8 表達條件的優化

初始pH值的優化：按上述方法誘導表達GS115重組菌，采用不同初始pH值(3、4、5、6、7)誘導表達96h，Tricine-SDS-PAGE分析表達產物。

甲醇誘導體積分數的優化：按上述方法誘導表達GS115重組菌，每24h添加甲醇分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，Tricine-SDS-PAGE分析表達產物，比較甲醇添加量不同對表達水平的影響。

1.3.9 表達產物的酶解與分離

將表達得到的500mL發酵液4℃、4000×g離心10min獲上清液，置于冰浴上，將硫酸銨固體緩慢加入蛋白溶液中，邊加邊攪拌，避免局部硫酸銨飽和度過高，但攪拌的時候注意不要攪出氣泡，加硫酸銨至50%，4℃、4000×g離心10min，沉淀用50mL PBS重新溶解，用1mol/L HCl溶液調整溶液 pH值至2.0。加入終質量濃度為2mg/mL的胃蛋白酶，37℃水浴4h，在融合肽中酸性多肽和堿性多肽之間連接的疏水性氨基酸Phe、Tyr之間切開，形成酸性多肽和堿性多肽產物，85℃、10min滅酶。將滅酶后的酶解液迅速冷卻，12000×g離心20min去除沉淀的酸性多肽部分，上清液用1mol/L的NaOH調pH值至6.0，－20℃保存。

1.4 酶解蛋白抑菌作用研究

濾紙用打孔器制作成直徑為4mm的圓形濾紙片，121℃高壓滅菌后干燥備用。將枯草芽孢桿菌在液體LB培養基中37℃、170r/min過夜振蕩培養后，與預先準備好的滅菌固體LB培養基在45℃左右按1：100混合均勻，倒入無菌培養皿中，用無菌鑷子將分別在酶解蛋白樣品，1g/100mL山梨酸鉀溶液、0.1g/100mL乳酸鏈球菌素溶液中浸泡過的濾紙片放置于平板上，37℃培養過夜。觀察抑菌圈的大小。

2 結果與分析

2.1 重組表達質粒pPIC9的構建

圖 1 重組質粒pPIC 9的酶切Fig.1 Restriction enzymes analysis of the recombinant plasmid

由圖1可知，泳道1是重組質粒用SalⅠ單酶切后獲得的條帶，大小為8000bp左右，泳道2為直接提取的質粒。為了進一步驗證，用5’AOX1和3’AOX1作為引物，重組質粒作為模板進行PCR，1.2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，在600bp處擴增出一條帶見圖2(泳道1)。進一步測序證實，說明基因已經連接到了質粒載體上。

圖 2 重組質粒pPIC9的PCR鑒定Fig.2 PCR analysis of the recombinant plasmid

2.2 GS115生長曲線

圖 3 畢赤酵母GS115生長曲線Fig.3 Growth curve of GS115

為了控制電轉化的條件，在轉化前要先測定菌株的生長條件，如圖3所示，在YPD中，30℃、170r/min條件下，GS115在14～20h為對數生長期，對應OD600nm值為0.6～6.9。對數期的細胞活力強，制備感受態細胞轉化率高。

2.3 GS115不同生長狀態對轉化率的影響

圖 4 細胞生長時期對轉化率的影響Fig.4 Effect of growth stage on transformation efficiency

在1.5kV、電容25μF、5ms、電阻200Ω電轉杯0.2cm條件下，分別選用處于不同對數生長階段(OD600nm值為0.6～6.9)的酵母細胞制備感受態進行電轉化并計算轉化率。圖4表明，用處于對數生長期的畢赤酵母進行電轉化，均有轉化子出現，但不同的生長階段對轉化率的影響很大，采用對數中期的酵母細胞即14h，OD600nm值為1.5時轉化效率最高，達到18個轉化子。

2.4 GS115陽性重組子的篩選

圖 5 重組畢赤酵母陽性克隆子的篩選Fig.5 Screening for positive clones of Pichia pastoris

受體菌GS115在組氨酸脫氫酶位點His4有突變，因而不能合成組氨酸，而表達質粒pPIC9有His4基因可與宿主進行互補，因此通過不含組氨酸的培養基(MD)來選擇His+轉化子。以MD上生長的GS115單菌落為模板，用酵母5’AOX和3’AOX通用引物進行PCR鑒定，如圖5所示，1.2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，泳道1無擴增條帶，陰性克隆(泳道2、5、6)在2200bp處有條帶，與酵母基因組AOX基因大小相符，而陽性克隆(泳道3、4)在600bp左右有一擴增條帶，與目的基因有關，說明基因已經整合到宿主酵母中。

2.5 抗菌肽的表達鑒定

圖 6 畢赤酵母表達產物的Tricine-SDS-PAGEFig.6 Tricine-SDS-PAGE analysis of peptide expressed in Pichia pastoris

目的融合肽的分子質量約為8kD，由于分子小，常規的SDS-PAGE的分離效果差，而在Tricine-SDSPAGE(16%分離膠，10%夾層膠，4%致密膠)上能得到較好的分離。如圖6所示，泳道1、2、3、4、5分別對應培養時間0、24、48、72、96h。結果表明，在BMMY培養基中，初始pH值為6，甲醇誘導體積分數為0.5%的條件下，發酵后72h開始有分子質量為8kD的蛋白得到表達，96h蛋白表達量較高。而陰性對照相應的位置無任何條帶。說明抗菌肽GS115中得以表達。細胞最佳收獲時間是誘導后96h。

2.6 表達條件的優化

圖 7 不同初始pH值對表達水平的影響Fig.7 Effect of initial pH on peptide expression level

由圖7可知，在BMMY培養基中，初始pH值為6.0，甲醇誘導體積分數為0.5%的條件下，泳道1、2、3、4、5分別對應初始pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，誘導96 h后的表達結果。在pH＜7.0時都有蛋白表達，pH4.0時表達量最高。由圖8可知，泳道1、2、3、4分別對應甲醇添加量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%。在改變甲醇添加量時，每24h添加終體積分數0.5%、1.0%的條件下有蛋白表達。

圖 8 不同甲醇添加量對表達水平的影響Fig.8 Effect of methanol concentration on peptide expression level

2.7 抑菌活性研究

圖 9 不同種類防腐劑的抑菌效果Fig.9 Antibacterial effect of different preservatives

由圖9可知，酶解上清液的抑菌直徑為0.8cm，而1g/100mL的山梨酸鉀抑菌直徑是0.6cm。0.1g/100mL的乳酸鏈球菌素抑菌直徑是1.3cm。說明酶解蛋白的抑菌活性介于山梨酸鉀和乳酸鏈球菌素之間。

3 討 論

畢赤酵母沒有天然的表達質粒，因此一般外源蛋白基因通過整合型質粒載體整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體復制而復制，不易丟失。整個體系較為成熟，容易達到較高的表達量，且易于大規模生產，是基因工程中應用較為廣泛的一種表達系統[16]。目前已經已有多種蛋白實現了成功表達，如各種抗菌肽、白蛋白、人胰島素、干擾素等[17-18]。表達載體pPIC9是分泌性質粒，在多克隆位點前有α-信號肽編碼序列，可引導外源蛋白分泌至胞外[19]，有利于蛋白下一步的分離純化。

在使用畢赤酵母表達系統表達外源基因時，電轉化是最常見且簡單易行的方法，但是影響轉化率的因素相當復雜。實驗表明，處于對數生長中期的酵母細胞最適合制作感受態用于電轉化，因為這個階段的細胞生長最為旺盛[19]，雖然在電擊條件下細胞死亡率較高，但是相對的存活的細胞較多，得到的轉化子的比例也較高。因此畢赤酵母的電轉化以培養到對數中期(OD600nm值為1.3～1.5)為宜。

本實驗在人工設計和合成一段多聚陽離子抗菌肽和多聚陰離子肽融合肽基因的基礎上，以畢赤酵母為表達系統，利用AOX1強啟動子成功地表達了目的蛋白，并在α因子信號肽的引導下分泌到胞外，Tricine-SDS-PAGE電泳分析表明表達的目的蛋白分子質量約為8kD，與理論值極相近。以SalⅠ酶線性化的重組質粒pPIC9-PCAP轉化GS115酵母細胞時，將在AOX1處以同源重組的方式插入酵母基因組中，產生Mut+型酵母重組子，它能在甲醇的誘導下表達外源蛋白。重組畢赤酵母轉化子中用甲醇誘導外源基因的表達時，控制甲醇體積分數十分重要。在培養中由于甲醇的消耗和揮發，若甲醇耗盡或體積分數太低，AOX1啟動子不能有效啟動，外源基因也就不能得到有效表達，所以需要人工后續添加甲醇。但若甲醇體積分數過高，對細胞會產生毒害作用。實驗表明在每24h添加終體積分數為0.5%～1.0%的甲醇時目的蛋白可以得到較好的表達。

蛋白酶降解蛋白是酵母表達系統存在的缺陷，降解不僅能引起目的蛋白的產率下降，降解形成的片段還會造成分離純化的困難。在發酵的過程中，隨著外源蛋白在培養基中的濃度不斷提高，蛋白水解酶濃度也隨著升高。由于畢赤酵母的pH值適應范圍比較廣，可以在pH3.0～7.0的范圍內生長，而不同的蛋白酶有不同的最佳pH值作用范圍，所以適當降低發酵pH值可以在不影響細胞的生長的情況下降低蛋白酶活性，減少目的蛋白的降解，提高外源蛋白的穩定性。本實驗中pH4.0時目的產物表達量最高可能與此有關。

表達得到的多聚陽離子抗菌肽抑菌效果與傳統的天然防腐劑Nisin相比不夠理想，可能是由于表達量偏低，在表達過程中融合肽有可能別自身蛋白酶酶解，且胃蛋白酶酶解效率不高，以致多聚陽離子抗菌肽可能沒有很好地與多聚陰離子肽分離，最終多聚陽離子抗菌肽有效濃度偏低。

本實驗采用畢赤酵母GS115和載體pPIC9對其分泌性重組表達，成功表達了具有活性的抗菌肽，表達產物具有較好的穩定性。影響外源蛋白在畢赤酵母中表達的因素很多[20-21]，如宿主菌的性質、信號肽、表達單元的拷貝數；轉錄和表達的效率、外源基因的序列、培養基、發酵參數等。 因此在對目的基因進行改造合成時，充分考慮了畢赤酵母的密碼子偏好性，并應用GS115的組氨酸營養缺陷型進行了篩選，并對發酵條件進行了初步優化。通過這些措施，使得抗菌肽能夠在重組酵母中得以表達。這不僅對抗菌肽的生產實驗、抗菌機理等研究具有重要意義，也為其開發成新型天然食品防腐劑和工業化生產奠定了一定的基礎。

融合表達雖可大量產生帶有抗菌肽片段的融合蛋白，但在體外活性分析還需對融合蛋白進行切割、分離、純化，并分析抗菌肽的抑菌活性；另外抗菌肽的表達量也需要提高。這些工作有待進一步完善。

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