保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌發酵夸克的工藝條件優化

胡 穎，蔣 緯，朱秋勁,2,3,*

(1.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學食品科學工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州省乳品工程技術研究中心，貴州 貴陽 550018)

夸克(Quark cheese)起源于德國，是新鮮干酪的重要品種之一。夸克不經過成熟處理，直接將牛乳凝固后去除部分水分制成，風味柔和清爽，質地柔軟濕潤，具有濃郁乳香及淡淡的乳酸味，在歐洲非常流行[1-3]。發酵劑與凝乳酶共同作用的夸克質地介于酸乳與酶凝干酪之間，口感易于我國消費者接受。有研究[4]表明，夸克生產過程中凝乳酶添加量過少會造成凝乳強度差，導致蛋白和脂肪等成分隨乳清排出，干酪產率低。但凝乳酶添加量過大則會影響干酪的風味和功能特性[5]。所以凝乳酶成為影響夸克品質的重要因素。生產夸克的傳統發酵菌種一般是乳酸鏈球菌(S. lactis)、乳脂鏈球菌(S. cremoris)、添加或不添加丁二酮乳酸鏈球菌(S. diacetilactis)或蝕橙明串珠菌(Leuconostoc citrovorum)[6-7]。然而，利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發酵制備夸克的研究在國內還鮮有報道。嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌因具有良好的共生作用而被廣泛應用于各類酸乳的研制中[8-10]，對兩種菌種共生機理的研究已有較多報道[11-13]。

本實驗利用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合發酵制備夸克。對夸克制作過程中凝乳酶的添加量、CaCl2添加量、混合發酵劑配比以及切割pH值等因素進行研究，以夸克成品校正產率、乳清OD500nm值、感官品質等為評定指標，旨在獲得以嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌為發酵劑制備夸克的較優工藝，為酸乳常用菌株在奶酪生產中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳粉 伊利乳業集團。

微生物凝乳酶(5000IU) 甘肅省華羚集團有限公司；保加利亞乳桿菌(Lactobacillus debruechii ssp. bulgaricus，Lb.) 廣東省微生物菌種保藏中心；嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilu，St.) 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；CaCl2、CuSO4均為分析純。

1.2 儀器與設備

TA.XT plus物性測試儀 英國Stable Micro System有限公司；DK-98-11K電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；pH100型筆式pH計 上海三信儀表廠；SHP-250型智能生化培養箱 上海光都儀器設備有限公司；SW-CJ-ZFD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；FA2004N電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；TDL-40B型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；MB35水分測定儀 Ohaus國際貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

脫脂乳→熱殺菌(95℃、5min)→冷卻至30℃左右→加入發酵劑→38℃預發酵2h→添加CaCl2、凝乳酶→32℃凝乳→切割→升溫攪拌排乳清→3000r/min離心8min排乳清→成品置于4℃冷藏

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 夸克校正產率的測定

夸克的校正產率是以每100kg原料乳所能生產出的水分含量為80%的凝塊的質量來計算[14]。

1.3.2.2 夸克乳清OD值的測定[15]

采用721紫外-可見分光光度計測定排除乳清在500nm波長處的光密度(OD500nm)值。

1.3.2.3 夸克水分含量的測定

采用水分快速測定儀進行測定。

1.3.2.4 夸克蛋白質的測定采用凱氏定氮法進行測定，參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》。

1.3.2.5 夸克固形物和蛋白回收率的測定[14]

原料乳及凝塊固形物含量測定按照GB 5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固體的測定》。夸克固形物回收率按式(3)計算，蛋白回收率按式(4)計算。

1.3.2.6 夸克質構測定

選用P/0.5型號探頭，采用下壓測力模式，測前速率1.0mm/s，測試速率1.5mm/s，測后速率10mm/s，感應力5g，下壓距離15mm，每個樣品測量3次，結果取平均值。

圖 1 下壓模式曲線分析圖Fig.1 The analysis chart of compression curve with a press mode

將待測樣品固定放置于探頭正下方，開始穿刺實驗。如圖1所示，當探頭感應到5g的觸發力后，就繼續穿刺樣品至15mm深度，然后在這點返回起始點，隨著穿刺深度的增加，所感應到的力也逐漸變大。當穿刺達到指定的深度時，所得的穿刺力值可以客觀的反映奶酪的硬度，每個樣品3次穿刺作功的測定可以反映出產品的品質均一性是否良好。曲線的負值區域表示探頭撤回時，有部分樣品黏在探頭上，反映了樣品的黏著性。測試完成后，宏程序會自動分析測試結果，獲得所需數據。

1.3.3 夸克感官品質的評定

根據夸克的滋氣味、組織狀態及色澤等指標對夸克的感官品質進行綜合評分，采取110分制，由10名食品專業人士分別打分，取其平均分為總感官評分。感官評分標準如表1所示。

表 1 感官評定評分標準Table 1 Standard of sensory evaluation

1.4 單因素及正交試驗設計

1.4.1 夸克生產工藝單因素試驗

根據預實驗結果，固定預發酵溫度38℃、預發酵時間為2h、凝乳溫度32℃、發酵劑接種量5%(V/V)，對影響夸克品質的主要因素即凝乳酶添加量、CaCl2添加量、嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌配比、切割pH值進行分析。

1.4.1.1 凝乳酶添加量的影響

固定CaCl2添加量0.02%、嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌配比1：1、切割pH值為4.6，將凝乳酶的添加量設計為0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%共6個水平梯度，以夸克校正產率和乳清OD500nm值為評價指標，研究凝乳酶添加量對夸克的影響。

1.4.1.2 CaCl2添加量的影響

凝乳酶添加量參照前面實驗結果，固定嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌配比1：1、切割pH值為4.6、CaCl2添加量設計0.00%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%共6個水平梯度，以夸克校正產率和乳清OD500nm值為評價指標，研究CaCl2添加量對夸克的影響。

1.4.1.3 發酵劑配比的影響

凝乳酶和CaCl2添加量參照前面的實驗結果，固定切割pH值為4.6、嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌配比設計1：3、1：1、3：2、2：1、3：1共5個水平梯度，以夸克校正產率和乳清OD500nm值為評價指標，研究發酵劑不同配比對夸克的影響。

1.4.1.4 切割pH值的影響

在前面試驗基礎上，設計3個切割pH值水平梯度(4.5、4.6、4.7)，以夸克校正產率和乳清OD500nm值為評價指標，研究切割pH值對夸克的影響。

1.4.2 夸克生產工藝條件優化試驗

在預試驗和單因素試驗基礎上，以感官評分為指標，進行凝乳酶添加量、CaCl2添加量、發酵劑配比以及切割pH值的四因素二水平的正交試驗，確定最佳工藝參數。

1.5 數據分析

采用SPSS18.0對數據進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 凝乳酶添加量對夸克的影響

文獻[16]報道，添加適當的凝乳酶，可使奶酪凝塊的組織狀態緊實，口感細膩柔和。乳清OD500nm值可間接反應奶酪凝乳狀況，一般來說，乳清中所含凝乳流失成分越多，OD500nm值越高。由圖2可知，在一定范圍內適當增加凝乳酶用量有利于提高夸克的校正產率，減少蛋白質、脂肪等物質的損失從而降低乳清OD500nm值。然而，凝乳酶添加量進一步增加，夸克的水分含量卻逐漸減少，產率逐漸降低，隨乳清流失的蛋白質、脂肪等卻不斷增加，乳清OD500nm值呈現一定的上升趨勢。

圖 2 凝乳酶添加量對凝乳效果的影響Fig.2 Effect of chymosin addition amount on coagulation efficiency

表 2 凝乳酶添加量對感官品質的影響Table 2 Effect of chymosin addition amount on sensory quality

由表2可知，凝乳酶添加量適當增加可幫助夸克形成致密的組織結構，同時也能有效提升夸克的滋氣味。但當凝乳酶的添加量大于0.020%以后，夸克表現水分含量少，組織較硬且易碎，并產生較為明顯的苦味。綜合各項指標，凝乳酶添加量在0.015%和0.020%時夸克的品質較好。

2.1.2 CaCl2添加量對夸克的影響

適量的CaCl2可以縮短凝乳時間，促進凝乳結構致密化。但是CaCl2添加量越大，奶酪苦澀的不良風味愈加明顯，同時奶酪凝乳收縮緊密導致乳清析出較多，造成奶酪感官品質的下降[17]。研究CaCl2不同添加量對夸克的影響，結果如圖3所示。

圖 3 CaCl2添加量對凝乳效果的影響Fig.3 Effect of CaCl2 addition amount on coagulation efficiency

由圖3可知，在一定范圍內適當增加CaCl2用量，有利于夸克產率的提高，并且在一定程度下降低乳清OD500nm值。然而繼續增加用量則使得產率迅速下降，乳清OD500nm值上升。這可能是由于CaCl2的添加在一定程度上縮短凝乳時間，當凝乳過快完成則使得乳中脂肪不能及時被酪蛋白結構包裹而隨乳清排出，從而造成產率降低。

表3 CaCl2添加量對感官品質的影響Table 3 Effect of CaCl2 addition amount on sensory quality

對CaCl2不同添加量所制備的夸克進行了感官評定，評分見表3。可以看出，CaCl2對于夸克的滋氣味、組織狀態及色澤都有一定程度的影響。CaCl2添加量過大會產生苦味從而導致了滋氣味變壞，加之夸克硬度隨著CaCl2添加量增大而不斷增大，當添加量到0.04%時，已有明顯的顆粒感。繼續添加至0.05%時，夸克就變得易碎且完全不具備涂抹性。綜合各項指標分析，CaCl2加量在0.02%和0.03%時夸克品質較好。

2.1.3 嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌配比對夸克的影響

圖 4 不同配比發酵劑對凝乳效果的影響Fig.4 Effect of starter culture ratio on coagulation efficiency

參照趙鑫等[18]的方法制備不同比例的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合菌發酵劑，按照5%的接種量對夸克進行預發酵，研究兩種菌按照不同比例制備的發酵劑對夸克的影響，結果如圖4所示。隨著嗜熱鏈球菌在混合菌中所占比例的不斷增加，夸克的校正產率在不斷減小，而乳清OD500nm值卻在不斷上升。這可能是由嗜熱鏈球菌產酸快使得凝乳時間縮短而造成的，這與秦南冰等[19]研究保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的比例變化對酸乳品質的影響結果一致。在他們的研究結果中，嗜熱鏈球菌較保加利亞乳桿菌而言，產酸速率更快。

表 4 發酵劑配比對感官品質的影響Table 4 Effect of starter culture ratio on sensory quality

對不同發酵劑配比所研制的夸克進行感官評分，結果見表4。對夸克的感官評定表明，隨著嗜熱鏈球菌比例的增加，夸克的酸味變得越來越為柔和，組織狀態也越來越黏稠。李志成等[20]研究報道指出，保加利亞乳桿菌后酸化程度較高而嗜熱鏈球菌產黏性較好。這就是隨著嗜熱鏈球菌比例升高夸克酸味變得柔和，組織狀態越來越黏稠的原因。綜合各項指標，當嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌比例為1：1和3：2時，所發酵夸克品質要優于其他配比。

2.1.4 切割pH值對夸克的影響

干酪的切割pH值過高，會使酪蛋白達不到凝聚等電點，從而造成大量的蛋白質隨乳清析出，切割pH值過低則又會使酸味過重，使產品產生風味缺陷[3]。在pH值分別為4.5、4.6、4.7時對夸克進行切割，其成品校正產率及乳清OD500nm值變化結果如圖5所示。

圖 5 切割pH值對凝乳效果的影響Fig.5 Effect of pH on coagulation efficiency

表 5 切割pH值對感官品質的影響Table 5 Effect of pH on sensory quality

從圖5和表5可以看出，pH值為4.7時，乳清OD500nm值最高達到2.753。這可能就是由于部分酪蛋白還未凝固從而隨著乳清流失造成的。pH值為4.6時，夸克的組織狀態最優。而pH值為4.5時，產率最高，說明低酸度有利于凝乳完全。綜合各項指標，切割pH值為4.5和4.6時所得夸克品質要優于pH4.7切割的品質。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，以感官評分為考察指標，進行正交試驗，試驗設計與結果如表6所示。

表 6 正交試驗結果及極差分析表Table 6 Range analysis of orthogonal tests

表 7 夸克理化、質構指標測定結果(±s)Table 7 Physio-chemical and textural parameters of Quark cheese(±s)

表 7 夸克理化、質構指標測定結果(±s)Table 7 Physio-chemical and textural parameters of Quark cheese(±s)

測定指標 理化指標 質構指標水分含量/% 固形物含量/%蛋白質含量/% 校正產率/% 蛋白回收率/%固形物回收率/%硬度/g黏著性/g穿刺作功/g測定結果78.15±0.11 19.22±0.05 12.77±0.07 23.01±0.10 81.08±0.0545.65±0.0699.71±0.12－(57.37±0.24) 651.16±0.12

由極差分析可以看出，所選各因素對夸克感官品質的影響主次排序為A＞B＞C＞D。即凝乳酶添加量＞ CaCl2添加量＞發酵劑配比＞切割pH值。而直觀分析結果所得夸克感官品質最優的工藝組合為第1組：A1B1C2D1，即凝乳酶添加量為0.015%，CaCl2添加量為0.02%，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的配比為3：2，切割時pH值為4.5。該組合條件下所得夸克的感官評分為98.25。由正交試驗所得最優組合為：A1B1C1D1，即凝乳酶添加量為0.015%，CaCl2添加量為0.02%，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的配比為1：1，切割時pH值為4.5。通過驗證實驗，該最優組合條件下夸克的感官評分僅為94.36，所以，最終確定夸克生產最優條件為A1B1C2D1。

2.3 夸克理化指標測定

對最佳工藝條件生產所得夸克，進行水分含量、固形物含量、蛋白質含量、粗產率、蛋白回收率、固形物回收率等理化指標的測定；并利用質構儀對夸克的硬度、黏著性及穿刺做功等質構指標進行測定，結果見表7。

測定得出夸克的蛋白質含量約為12.77%，凝塊中蛋白質回收率較高，達到了81.08%，固形物回收率約為45.65%，符合NY487—2002《軟質干酪》標準。夸克的硬度約為99.71g，與吳檳[14]利用有機酸生產的類夸克硬度相差不大。3個平行樣穿刺做功偏差為0.12，表明終產品夸克具有良好均一性的特點。

3 結 論

3.1 嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合發酵制備夸克，隨著嗜熱鏈球菌比例的增加，夸克的黏性增加，酸味越淡，而保加利亞乳桿菌所占比例越高，夸克硬度越低，且酸味越強烈。當嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌的比例達到為3：2時，夸克各項指標較好。說明嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌可以混合發酵用于夸克制作。

3.2 單因素試驗中，得出凝乳酶添加量為0.015%和0.02%，CaCl2添加量為0.02%和0.03%，嗜熱鏈球與保加利亞乳桿菌的比例達到為1：1和3：2，切割pH值為4.5和4.6時，夸克各項考察指標優于其他試驗組。對正交試驗進行極差分析可知，各因素對夸克品質的影響程度依次為凝乳酶添加量＞CaCl2添加量＞嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌配比＞切割pH值。

3.3 對最優工藝進行驗證實驗，得到凝乳酶添加量為0.015%，CaCl2添加量為0.02%，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的配比為3：2，切割時pH值為4.5時，夸克的感官評分為98.25。此時，夸克具有濃郁奶香、口感清爽酸味柔和、組織細膩、具有良好的硬度和黏性。

[1] 胡萍. 夸克的制作[J]. 食品工業科技, 2001, 22(2)： 56-57.

[2] 劉忠成. Quark干酪超濾生產工藝的研究[D]. 哈爾濱： 東北農業大學, 2010.

[3] 張玲改. 夸克生產關鍵工藝研究[D]. 北京： 中國農業大學, 2005.

[4] SOHAL T S, ROEHL D. Rennet as a canse of bitterness development in quarg[J]. Journal of Dairy Science, 1988, 71： 3188-3196.

[5] 范素琴, 王成忠, 于功明. 凝乳酶的研究進展及在干酪生產中的應用[J]. 農業食品科技, 2009, 3(2)： 40-42.

[6] KROGER M. The manufacture of quarg cheese[J]. Cult Dairy Prod, 1980, 15(3)： 11.

[7] SIGGELKOW M. Mordern methods in Quarg production for consumer sale[J]. Dairy Industry International, 1984, 49(6)： 17.

[8] 丁玉萍, 呂冬云, 吳玉德. 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵豆乳促進生長劑的研究[J]. 食品與發酵工業, 2005, 31(12)： 120-122.

[9] 李江, 張富新, 任娟, 等. 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在羊奶中的發酵特性研究[J]. 陜西師范大學學報： 自然科學版, 2010, 38(3)： 91-94.

[10] 盧兆蕓, 陳海嬰, 彭冬英, 等. 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵紫紅薯酸牛奶[J]. 中國乳品工業, 2011, 39(12)： 39-49.

[11] 王坤, 閆穎娟, 姜梅, 陳曉紅, 等. 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生物膜形成研究[J]. 食品科學, 2011, 32(19)： 184-187.

[12] 吳榮榮, 馬靜, 裴家偉, 等. 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌相互作用研究[J]. 中國乳品工業, 2003, 31(4)： 9-13.

[13] 包維臣, 陳霞, 邵玉宇, 等. 保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌共生機理的研究進展[J]. 中國乳品工業, 2011, 39(12)： 20-23.

[14] 吳檳. 直接酸化法生產類夸克技術的研究[D]. 哈爾濱： 東北農業大學, 2010.

[15] 李偉, 吳檳, 李金寶, 等. 鈣試劑和溫度對農家干酪品質及乳清OD值的影響[J]. 中國乳品工業, 2011, 39(8)： 25-27.

[16] 柳艷霞, 趙改名, 張秋會, 等. 新鮮干酪工藝研究[J]. 食品科學, 2007, 28(8)： 215-218.

[17] 薛璐, 胡志和. 中式傳統奶酪不良風味脫除方法的比較[J]. 食品科學, 2009, 30(16)： 206-209.

[18] 趙鑫, 趙洪雙, 姜國龍. 不同比例的嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌對酸奶品質的影響[J]. 農產品加工, 2009(3)： 177-180.

[19] 秦南冰, 李妍, 袁珠妮, 等. 保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的比例變化對酸奶品質的影響[J]. 中國乳品工業, 2011, 39(2)： 37-39.

[20] 李志成, 閆亞美, 張連斌, 等. 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌產酸產粘特性研究[J]. 中國乳品工業, 2008, 34(5)： 8-10.