響應面法優化長雙歧桿菌增殖培養基

孫 鵬，趙旭博，孫先鋒，馬永征

(1.西安工程大學環境與化學工程學院，陜西 西安 710048；2.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；3.北京市食品研究所，北京 100162)

雙歧桿菌是廣泛存在于人體和動物腸道內的有益菌，具有促進機體對營養物質的吸收，調節腸道菌群平衡，增強免疫力，抗癌及抗腫瘤，降低血脂、保護及改善肝功能、調理腸道內環境、抗衰老、通便等功能[1-3]，但要實現上述功能，產品中的雙歧桿菌在保質期內必須保持在106CFU/mL(106CFU/g)以上[4]，因此提高雙歧桿菌的活菌數是產品開發的關鍵，培養基優化是提高活菌數的常用手段之一。

目前雙歧桿菌活菌數的提高主要通過在培養基中添加果蔬汁如胡蘿卜汁、番茄汁、平菇汁、卷心菜汁等[5-9]，益生元如低聚果糖、菊糖及魔芋葡萄甘露低聚糖等[10-12]，蛋白質及其水解產物如酪蛋白水解物、乳清蛋白水解物、乳鐵蛋白及乳清蛋白等[13-16]等來實現，或以天然提取物如菊芋汁、麥芽汁等[17-19]為培養基主要成分通過培養基優化來提高雙歧桿菌活菌數。如韓雪等[5]從海帶汁、平菇汁及胡蘿卜汁等果蔬汁中篩選了兩株雙歧桿菌的增殖因子，并通過正交試驗進行了雙歧桿菌培養基的優化；劉子宇等[6]以TPYG培養基為基礎培養基，采用響應面法優化了Bifidobacterium breve A04培養基；杜鵬等[7]采用采用單因素試驗和正交試驗優化了嬰兒雙歧桿菌發酵培養基；胡德亮等[18]研究了菊芋對雙歧桿菌促生長的影響；孫記錄等[19]篩選優化了菊芋汁雙歧桿菌培養基；Oliveira等[10]研究發現添加菊糖能縮短嗜熱乳鏈球菌和乳雙歧桿菌酸乳發酵時間，并提高了活菌數；Prasanna等[13]研究了乳清蛋白水解物等幾種氮源對長雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌生長和產多糖的影響，發現在脫脂乳中添加1.5%酪蛋白水解物能促進雙歧桿菌的生長；Kim等[15]研究發現牛乳鐵蛋白能促進短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的生長；Janer等[16]研究發現酪蛋白巨肽(caseinomacropeptide，CMP)和乳清蛋白濃縮物(whey protein concentrate，WPC)能促進乳雙歧桿菌的生長，乳中添加20g/L CMP在37℃條件下培養24h能使活菌數提高1.5(lg(CFU/g))，添加20g/L WPC可使乳雙歧桿菌活菌數對數值達到9.1(lg(CFU/g))。

但添加果蔬汁會導致培養基配制步驟增加，操作繁瑣，不適宜用于工業化。文獻中添加益生元一般僅選擇添加某一種低聚糖或菊糖，沒有考慮各種低聚糖或菊糖對該菌株生長的影響。此外，沒考慮在培養基中添加氨基酸對雙歧桿菌生長的影響。本研究以長雙歧桿菌為實驗對象，通過碳源、益生元及氨基酸單因素試驗及Plackett-Burman試驗設計篩選出主因子，再通過爬坡試驗、Box-Behnken試驗設計及響應面分析對長雙歧桿菌的增殖培養基進行優化，以提高活菌數，為進一步開發雙歧桿菌產品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum) 西安工程大學環境與化學工程學院菌種室保藏。

1.1.2 培養基與試劑

活化培養基：MRS肉湯，并添加0.5g/L濾膜過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽；計數培養基：MRS瓊脂；基礎培養基：無碳源MRS肉湯。

葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、水蘇糖及菊糖 西安羅森伯生物科技有限公司；氨基酸 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F無菌操作臺 蘇州凈化設備有限公司；DH5000AB電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；756PC紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；BS224S型電子天平 德國賽多利斯公司；PHS-3C型酸度計 上海精科儀器有限公司；厭氧裝置(厭氧培養罐、產氣袋及氧氣指示劑) 日本三菱公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將半胱氨酸鹽酸鹽配成濃溶液，然后采用0.22μm的濾膜過濾除菌，再將其添加到滅菌冷卻后的MRS肉湯中，使其終質量濃度為0.5g/L，將其用來活化凍干的長雙歧桿菌菌粉，37℃厭氧培養24h，按體積分數5%接種量接種，活化3次后備用。

1.3.2 培養基優化

根據生長曲線確定培養時間，同時首先通過單因素試驗分別考察4種碳源(乳糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖)、6種益生元(低聚果糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖、水蘇糖和菊糖)、8種氨基酸(亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和絲氨酸)對長雙歧桿菌生長的影響，獲得能促進長雙歧桿菌生長的物質，再采用Plackett-Burman(PB)試驗篩選主因子，接著進行爬坡試驗確定最大活菌數區域，最后通過Box-Behnken試驗設計及響應面分析確定最佳培養基組成，Plackett-Burman和Box-Behnken試驗設計及數據處理均利用Design Expert 8.06軟件完成。

1.3.3 OD值及pH值測定

采用紫外-可見分光光度計法測定培養液在600nm波長處的濁度(OD600nm值)，未接入菌的培養基作為對照。通過PHS-3C酸度計測定培養液pH值。

1.3.4 活菌數測定

培養液采用10倍梯度稀釋，選取適當稀釋度傾注平板，使其均勻分布于培養基中，37℃厭氧培養48h后計數菌落數。

2 結果與分析

2.1 長雙歧桿菌生長曲線

將已活化好的長雙歧桿菌按照體積分數5%接種量接入含0.5g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯中，充分混勻后37℃培養24h，每隔2h取樣測定其在600nm波長處的OD600nm值、培養液pH值及活菌數，以這3個指標繪制生長曲線，如圖1所示。

圖 1 長雙歧桿菌在MRS肉湯中的生長曲線Fig.1 Growth curve of Bifi dobacterium longum in MRS broth

由圖1可知，0～4h為長雙歧桿菌生長的延滯期，然后進入對數生長期，至18h進入穩定期，然后進入衰亡期，最佳培養時間為18h，此時活菌數為8.96×108CFU/mL，OD600nm值為1.154，pH值為5.15。在培養18h后，活菌數逐漸下降，而OD600nm繼續增加，pH值緩慢降低，但18h后的OD600nm值不能反映培養液中的活菌數，18h之前的OD600nm值曲線和活菌數曲線趨勢一致，因此在穩定期前的OD600nm值能反映長雙歧桿菌的生長情況。在后續的單因素試驗中測定18h的OD600nm值來判斷各物質對長雙歧桿菌生長的影響。

2.2 碳源、益生元及氨基酸對長雙歧桿菌生長的影響

2.2.1 碳源對長雙歧桿菌生長的影響

在無碳源的MRS肉湯中分別加入葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖，并將質量濃度分別調整為10、15、20、25、30g/L，118℃滅菌20min，冷卻后加入過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽，再按體積分數5%的接種量接入長雙歧桿菌，37℃條件下恒溫培養18h后測定OD600nm值，結果如圖2所示。

圖 2 碳源對長雙歧桿菌生長的影響Fig.2 Effect of carbon source on the growth of B. longum

由圖2可知，隨著碳源添加量的增加，培養液的OD600nm值均先增大后減小，在葡萄糖、乳糖及麥芽糖質量濃度為20g/L及蔗糖質量濃度為15g/L時，培養液的OD600nm值達到最大值，分別為1.146、1.190、1.024、0.987，說明長雙歧桿菌對這4種糖的利用率大小順序為乳糖＞葡萄糖＞麥芽糖＞蔗糖，其中碳源為蔗糖及麥芽糖時不利于長雙歧桿菌的生長，其OD600nm值與葡萄糖和乳糖作為碳源的結果存在顯著性差異(P＜0.05)，同時，葡萄糖和乳糖的最大OD600nm值間也存在顯著性差異(P＜0.01)，因此乳糖為該菌的最佳碳源，在后續研究中以乳糖為該菌的碳源。

2.2.2 益生元對長雙歧桿菌生長的影響

圖 3 益生元對長雙歧桿菌生長的影響Fig.3 Effect of prebiotics on the growth of B. longum

在以20g/L乳糖為碳源的MRS肉湯中分別加入低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、水蘇糖及菊糖6種益生元，并將質量濃度分別調整為2、4、6、8、10g/L，118℃滅菌20min，冷卻后加入過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽，再按體積分數5%的接種量接入長雙歧桿菌，37℃條件下恒溫培養18h后測定OD600nm值及pH值，結果如圖3所示。隨著益生元添加量的增加，培養液的OD600nm值均出現了先增加后降低的情況，但均高于對照，說明益生元的添加能促進長雙歧桿菌的生長。培養液OD600nm值最大時的益生元添加量分別為低聚果糖4g/L、低聚木糖2g/L、低聚異麥芽糖6g/L、低聚半乳糖8g/L、水蘇糖2g/L及菊糖4g/L，對應的OD600nm值分別為1.149、1.275、1.081、1.184、1.093及1.269，其中低聚異麥芽糖和水蘇糖添加量對該菌的生長沒有顯著的促進作用(P＞0.05)，其他4種益生元均能顯著性促進該菌的生長(P＜0.05)，其中以低聚木糖最佳、其次為菊糖和低聚異麥芽糖，最后為低聚果糖。

2.2.3 氨基酸對長雙歧桿菌生長的影響

將以20g/L乳糖為碳源的MRS滅菌冷卻后，分別加入過濾除菌的亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸及絲氨酸8種氨基酸的濃溶液，并將其質量濃度均調整為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L，然后加入過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽，最后按體積分數5%的接種量接入長雙歧桿菌，37℃條件下恒溫培養18h后測定OD600nm值及pH值，結果如圖4所示。

圖 4 氨基酸對長雙歧桿菌生長的影響Fig.4 Effect of amino acid on the growth of B. longum

由圖4可知，隨著氨基酸添加量的增加，培養液的OD600nm值均出現了先增加后降低的情況。培養液OD600nm值最大時的氨基酸添加量為：亮氨酸0.2g/L、谷氨酸0.3g/L、精氨酸0.2g/L、賴氨酸0.2g/L、蛋氨酸0.3g/L、脯氨酸0.1g/L、苯丙氨酸0.4g/L及絲氨酸0.3g/L，對應的最大值分別為1.062、1.121、1.058、1.111、1.132、1.130、1.148及1.063，其中亮氨酸、精氨酸及絲氨酸對該菌的生長沒有顯著的促進作用(P＞0.05)，其他5種氨基酸均能顯著性促進該菌的生長(P＜0.05)，其中以苯丙氨酸最佳、其次為蛋氨酸和脯氨酸，最后為谷氨酸和賴氨酸。

2.3 Plackett-Burman試驗設計篩選主要影響因子

根據單因素試驗結果，選用N=12的Plackett-Burman試驗設計對低聚木糖、菊糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖、苯丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酸和賴氨酸9個因素進行考察，每個因素取高(+1)低(－1)兩個水平，高水平約為低水平的1.25倍，響應值為單位體積中長雙歧桿菌活菌數的對數值(Y)，試驗設計及結果見表1，其中X6和X11為虛擬項；因素水平取值、效應及顯著性分析見表2。

表 1 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 1 Experimental results of Plackett-Burman design

表 2 Plackett-Burman試驗結果及方差分析Table 2 The levels of Plackett-Burman tests and analvsis of variance

由表2可知，在培養長雙歧桿菌的過程中，在α=0.10的顯著水平上，低聚木糖、菊糖和脯氨酸添加量對長雙歧桿菌活菌數的對數值影響顯著，其中低聚木糖和菊糖添加量對培養液中雙歧桿菌活菌數對數值的影響為負效應，脯氨酸為正效應，可考慮作為主要因素進一步做響應面試驗。

2.4 爬坡試驗設計及結果

表 3 最陡爬坡試驗結果Table 3 Results of the steepest ascent experiment

響應面擬合方程只有在考察的鄰近區域里才能充分近似真實情況，所以應先逼近最大影響區域后再建立有效的擬合方程。根據PB試驗結果，針對低聚木糖、菊糖和脯氨酸添加量進行最陡爬坡實驗，結果如表3所示。各因素的取值在第3組(0+2Δ)附近時培養液中長雙歧桿菌活菌數對數值最高，故采用低聚木糖1.6g/L、菊糖3.4g/L和脯氨酸0.4g/L為后續響應面試驗的中心點。

2.5 響應面設計確定顯著影響因素的最佳值

根據最陡爬坡試驗確定的試驗因素中心點，采用Box-Behnken試驗設計對長雙歧桿菌發酵培養基進行優化，各因素水平選擇如表4所示，其結果如表5所示。

表 4 Box-Behnken試驗因素水平及其編碼Table 4 Fractors, levels and codes of Box-Behnken design

表 5 Box-Behnken試驗設計及結果Table 5 Experimental design and results of Box-Behnken tests

根據表5中Box-Behnken試驗設計結果，采用Design Expert 8.06軟件響應面分析程序對其進行回歸擬合，得到二次多元回歸模型為：Y=9.22+0.041A+0.038B+0.010C－0.00008AB+0.010AC+0.0099BC－0.43A2－0.019B2－0.014C2，對二次模型進行方程分析，結果如表6所示。模型P=0.0042＜0.01，失擬項P=0.1595＞0.05，相關系數R2=96.38%，表明模型的相關性很好，R2Adj相關系數為89.85%，表明響應面的89.85%的變化可以由此模型解釋，模型與實際情況擬合的很好。變異系數CV越低，試驗的可信度和精確度越高，變異系數為0.18，試驗數據可靠，分析結果可信，因此可以用此回歸方程對實驗結果進行分析和預測。

表 6 模型回歸方程方差分析Table 6 Analysis of variance of regression equations

由表6還可看出，在α=0.05的顯著水平上，A、B、及A2是顯著的，AC(低聚木糖和脯氨酸)及BC(菊糖和脯氨酸)有一定的交互作用，但均不顯著。利用Design-Expert軟件對回歸模型進行響應面分析，得到各響應面的二維等高線和三維立體圖(圖5～7)，等高線圖的圓心越接近橢圓表示交互作用越強，等高線的稀疏表示響應面圖形的平陡。由3組圖可知，增殖培養基中長雙歧桿菌活菌數的對數值在設定的濃度范圍內都有一個最大值，采用Design-Expert軟件的Optimization模塊，對增殖培養基進行優化，在各物質實驗添加量的范圍內，預測低聚木糖、菊糖及脯氨酸添加量分別為1.7、3.6、0.4g/L時，長雙歧桿菌活菌數對數值的最大值為9.2489。采用上述最優添加量培養長雙歧桿菌，實際獲得5組平行實驗平均發酵液中長雙歧桿菌活菌數為(1.75±0.02)×109CFU/mL，其對數值為9.244±0.006，與預測值接近，可見該模型能較好地預測實際發酵液中長雙歧桿菌活菌數的對數值。

圖 5 低聚木糖與菊糖對長雙歧桿菌生長影響的等高線圖及響應面圖Fig.5 Surface and contour plots for the effect of xylooligosaccharide and inulin on the growth of B. longum

圖 6 低聚木糖與脯氨酸對長雙歧桿菌生長影響的等高線圖及響應面圖Fig.6 Surface and contour plots for the effect of xylooligosaccharide and proline on the growth of B. longum

圖 7 菊糖與脯氨酸對長雙歧桿菌生長影響的等高線圖及響應面圖Fig.7 Surface and contour plots for the effect of inulin and proline on the growth of B. longum

3 結 論

實驗證明，Plackett-Burman設計與響應面方法(RSM)相結合的試驗統計方法能快速、有效地從眾多影響長雙歧桿菌液體培養的因素中篩選出比較重要的影響因素，并實現條件優化，得到最佳營養，優化結果與實際培養情況吻合較好。

通過單因素試驗發現長雙歧桿菌的最佳碳源為乳糖，低聚木糖、菊糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖、苯丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酸及賴氨酸能顯著促進長雙歧桿菌的生長。利用Design Expert 8.06軟件進行了主要影響因子篩選和響應面優化，主要影響因子為低聚果糖、菊糖及脯氨酸，優化后的發酵培養基為：將MRS中的碳源葡萄糖替換為乳糖20g/L，再加入低聚木糖1.7g/L、菊糖3.6g/L、脯氨酸0.4g/L和半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/L，37℃厭氧培養18h后其活菌數達(1.75±0.02)×109CFU/mL，比優化前提高了95.64%。

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