嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖對小鼠免疫相關基因的調控

楊相宜，滿朝新，劉 穎，王今雨，郎 友，董鑫悅，閆天文，姜毓君,,*

(1.東北農業大學食品學院 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農業大學 國家乳業工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150086)

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)是人體小腸內的主要益生菌，具有調整腸道菌群平衡，抑制腸道不良微生物的增殖，增強免疫和延緩機體衰老等作用。嗜酸乳桿菌胞外多糖(EPS)是嗜酸乳桿菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外、易與菌體分離的水溶性多糖，屬于次級代謝產物。大量研究表明，胞外多糖安全無毒，具有免疫調節、抗腫瘤、降膽固醇和抗氧化等益生作用[1-2]，因此備受人們的關注。現有研究表明，胞外多糖可以作為一種天然的食品添加劑，有效抑制有害微生物生長，并且對人體有益[3]。有研究發現，嗜酸乳桿菌的免疫調節作用與其分泌的胞外多糖有很大的關系[4]。目前，對于胞外多糖的研究很多，但極少有人從宿主免疫相關基因角度入手分析胞外多糖對機體的免疫調節作用。由于CCL2和IL18在提高宿主免疫功能的過程中發揮著重要的作用，本實驗對嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖作用于小鼠腸組織后引起的CCL2和IL18基因的表達變化進行研究，為更深入了解嗜酸乳桿菌的生理功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆明系小鼠，體質量平均為(20±2)g，購自黑龍江省醫科大學實驗動物中心。

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM由丹麥丹尼斯克公司(Danisco)惠贈。

總RNA提取試劑Trizol Reagent 美國Invitrogen公司；Ex ScriptTMRT-PCR Kit、SYBR Premix Ex TapTMII 大連TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備

ABI7500實時熒光PCR儀 美國ABI公司；G1-21M冷凍離心機 上海市離心機械研究所；LGJ-1型冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；UVP凝膠成像系統 美國UVP公司。

1.3 胞外多糖的提取

將實驗室保存的嗜酸乳桿菌NCFM活化后，按3%接種量接入MRS培養基中，37℃培養24h后，8000r/min、4℃離心15min，取上清液。將上清液減壓濃縮至1/3體積，酶解后用Sevag法(氯仿、正丁醇體積比5：1)除蛋白。再經過過氧化氫脫色、乙醇沉淀多糖、透析、凍干，得粗胞外多糖(EPS)粉末。將粗EPS溶于去離子水，經DEAE-Sephadex離子交換柱純化，最后濃縮、透析、凍干得到一種白色纖維狀疏松固體，該物質極易溶于水，水溶液顯酸性。用苯酚-硫酸法檢測所得物質純度[5]。

1.4 構建小鼠模型

本實驗采用昆明系小鼠(20±2)g，雌雄各半，自由采食，分為對照組(每天灌胃生理鹽水)、實驗組(灌胃劑量為100mg/(kg·d)胞外多糖)。連續灌胃14d，分別在0、1、4、7、10、14d處死小鼠，每個時間點每組10只，取胸腺和脾臟稱質量，計算臟器系數[2]。取小鼠空腸和回腸，用Trizol法提取腸組織RNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測并測定其波長260nm和280nm處的光密度值，計算OD260nm/OD280nm比值，分析純度。

式中：md為臟器的絕對質量(肝臟質量+脾臟質量)/mg；mb為小鼠體質量/g。

1.5 Real-time RT- PCR驗證小鼠免疫相關基因

1.5.1 引物設計

在GenBank中查找出各基因的序列，使用Primer 5.0軟件對各差異表達基因進行跨內含子設計引物，見表1，實驗利用GAPDH作為內參基因，消除本底模板差異。

表 1 待測基因Real-time RT PCR引物的堿基序列、Tm值及擴增產物的大小Table 1 Base sequences and Tm of specific oligonucleotide primers for RT-PCR as well as the sizes of PCR products

1.5.2 反轉錄反應條件

反轉錄條件：37℃、15min；85℃、5s。Real-time PCR反應條件：95℃預變性10s；95℃變性5s，60℃退火34s，循環40次，20μL體系。

1.5.3 統計分析

將每個待測樣品均設3個重復，利用2 -ΔΔCt法對目的基因的相對表達量進行評價。所得數據利用SPSS 18.0軟件進行分析，采用單項方差分析法計算3次重復得到的相對定量的標準差，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 苯酚-硫酸法測胞外多糖含量

葡萄糖標準曲線y=0.9657x－0.018(R2=0.9955)，線性關系良好，可以用于計算胞外多糖純度。通過計算，胞外多糖純度為87.93%。將所得胞外多糖溶于Tris中，進行蛋白電泳測定，泳道無條帶(圖未附加)，表明無蛋白殘留，可用于后續實驗。

2.2 臟器系數

表 2 嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖對小鼠免疫臟器器官的影響Table 2 Effect of exopolysaccharide produced by Lactobacillus acidophilus NCFM on immune organs of mice

胸腺和脾臟是最重要的免疫器官，為了研究胞外多糖是否可以促進免疫器官發揮免疫調節作用，本實驗取小鼠胸腺和脾臟稱質量，分析胞外多糖對其質量變化的影響。由表2可知，隨著時間的延長，對照組的臟器系數略升高，實驗組的臟器系數明顯升高。且與對照組相比，實驗組可以顯著增加臟器的質量(P＜0.05和P＜0.01)。說明嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖可以促進免疫器官質量增加，進而起到促進免疫功能的作用。

2.3 小鼠免疫相關基因CCL2和IL18的驗證

2.3.1 RNA提取和純度檢測

測定所提取的總RNA的OD260nm、OD280nm值[6]，算得OD260nm/OD280nm均在1.8～2.2范圍內(實驗組為2.01，對照組為2.07)，表明所提取的總RNA純度較高，沒有蛋白質和DNA殘留。經1%瓊脂糖凝膠電泳后，18S RNA和28S RNA電泳條帶清晰，5S RNA較暗，無明顯降解(圖1)。說明總RNA質量完好，結果合格，可以進行Real-time RT- PCR實驗。

圖 1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA

2.3.2 Real-time PCR驗證

圖 2 Real-time RT PCR驗證的CCL2基因溶解曲線(a)和擴增曲線(b)Fig.2 Solubility(a) and amplification curves(b) of RT-PCR for CCL2 gene

本實驗室此前已經通過嗜酸乳桿菌NCFM灌胃小鼠發現其能誘導免疫基因的表達。為進一步分析嗜酸乳桿菌NCFM所分泌胞外多糖對小鼠腸組織免疫相關基因表達的動態變化趨勢，利用嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖灌胃小鼠，分別在1、4、7、10、14d處死小鼠，提取腸組織，然后采用Real Time RT-PCR方法對免疫相關基因IL18和CCL2的表達進行檢測，并以管家基因GAPDH作為內參基因[7]。

圖 3 Real-time RT PCR驗證的IL18基因溶解曲線(a)和擴增曲線(b)Fig.3 Solubility(a) and amplification curves(b) of RT-PCR for IL18 gene

圖 4 CCL2基因的相對表達量Fig.4 Relative expression of CCL2 gene

圖 5 IL18基因的相對表達量Fig.5 Relative expression of IL18 gene

圖2和圖3是基因CCL2和IL18的Real-time RT-PCR的溶解曲線和擴增曲線。由此可知，溶解曲線單一，擴增曲線呈現標準的S型，表明擴增效果良好，所得到的數據可以用于計算。圖4、5是灌胃小鼠14d，不同時間點處死小鼠，腸組織中免疫相關基因CCL2和IL18的表達量的變化情況。CCL2基因一直呈現上調表達，IL18基因除第1天下調表達外，其余時間點均呈現上調表達，且與對照組相比差異顯著。隨著時間的延長，CCL2和IL18基因的表達呈現出先迅速增加后減小的趨勢，且均在第4天達到最大值，與對照組相比，差異極顯著(P＜0.001)。說明嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖對免疫相關基因具有明顯的調控作用。

3 討 論

目前，已有很多學者研究多糖的益生作用，發現不同的多糖具有不同的免疫調節作用，對于生理功能的發揮起到了重要作用[8]。已有大量研究表明，乳酸菌的部分生理功能與其分泌的胞外多糖緊密相關[9]。對于胞外多糖的提取方法目前比較成熟，但由于某些小分子肽類、油脂和蛋白等物質會與胞外多糖緊密結合，所以完全得到極高純度的胞外多糖尚沒有辦法完成，只能制備相對純度的胞外多糖。雖然如此，這些蛋白等雜質卻并不會對胞外多糖與機體發揮免疫作用造成很大的影響，有些糖蛋白甚至會促進胞外多糖的活性[4,10-11]。實驗室前期已經研究了嗜酸乳桿菌NCFM對Caco-2細胞免疫相關基因的調控，為了進一步研究嗜酸乳桿菌NCFM分泌物的重要作用，本實驗圍繞其所分泌的胞外多糖對小鼠腸組織的免疫相關基因的調節作用進行了研究。

白介素-18(IL-18)，又稱γ干擾素(IFN-γ)誘生因子，屬白介素-1家族，是一種誘導IFN-γ合成的中介分子，在機體的免疫調節中起著重要的作用。它能刺激T細胞增殖，增強自然殺傷細胞活性，參與細胞因子的生成等，與白介素-12產生協同作用[10]。趨化因子是一類能夠趨化細胞的遷移的小分子分泌蛋白，細胞沿著趨化因子濃度增加的信號向趨化因子源處的遷徙，有些趨化因子在免疫監視過程中控制免疫細胞趨化。CCL2是趨化因子CC亞家族中的一員，能夠趨化和激活T淋巴細胞和單核細胞，使免疫細胞向病變部位聚集[12]，從而起到免疫調控作用。也有報道稱，CCL2可以通過抑制單核細胞，同時刺激IL4的分泌，進而抑制腫瘤免疫[13]。有研究表明IL18和CCL2 mRNA水平的提高都會伴隨著蛋白表達的提高，而且這些基因的表達也可以直接表明對DCs等免疫細胞具有影響。因此可以根據mRNA水平的變化間接反映蛋白水平的變化以及胞外多糖對相關免疫細胞的調節作用[14-17]。在本實驗中，我們發現嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖可以使IL18和CCL2的表達量顯著升高，也可表明胞外多糖可以使IL18和CCL2的蛋白表達量上調，驗證了胞外多糖可以促進機體的免疫活性。

雖然免疫相關基因IL18和CCL2在機體免疫反應中起到非常重要的作用，但是長期的表達會對機體造成過免疫過度，導致組織受損[18-19]。從本實驗的結果可知，CCL2和IL18隨著實驗時間的延長，表達量均趨向于未作用組的表達量(圖4、5)，表明嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖只是暫時性的誘導免疫相關基因的表達，這就使得胞外多糖既可以增強機體免疫功能，又不會引起免疫過度，造成機體損害。另外，CCL2和IL18的表達趨勢雖然相似，但第4天達到最大表達量的值卻相差甚遠。有研究表明，免疫相關基因的表達依賴于機體免疫信號通路[20]，添加信號通路抑制劑會導致免疫相關基因的表達量明顯下降[21-22]。CCL2和IL18通過不同信號通路進行表達，再加上CCL2和IL18與其他細胞因子的相互作用不同，這可能是導致它們的表達量出現偏差的原因。

綜上所述，嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖能夠增強機體的免疫反應，具有一定的免疫調節作用，為今后利用這種物質開發新功能性食品提供了新的線索。

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