小黑豆乳清蛋白和水解多肽對小鼠急性肝損傷的保護作用

樊 迎，王常青*，王 菲，于書佳，連偉帥，原 敏

(山西大學生命科學學院，山西 太原 030006)

黑豆(Glycine soja Sieb.et Zucc)異名烏豆、冬豆子，系豆科植物大豆的干燥種子，按其顆粒大小可分為大黑豆和小黑豆兩種，小黑豆的主要產區在山西、陜西、寧夏等省份及黃土高原地區[1]。其蛋白質含量高達48%以上，居豆類之首。小黑豆乳清蛋白(small black beans whey protein，SBWP)存在于加工黑豆分離蛋白和豆制品過程中排放的廢水中，初步估算，每生產1t的分離蛋白會排放20～30m3的乳清廢水。近年來已有關于大豆乳清蛋白抗腫瘤和大豆多肽抗疲勞和保肝的報道[2-3]，但是尚未見到SBWP以及小黑豆乳清水解多肽(small black beans whey peptides，SBWPE)抗肝損傷作用的研究。分析表明，本實驗所用的SBWP和SBWPE的氨基酸組成基本符合聯合國糧農組織/世界衛生組織(FAO/WHO)頒布的人體氨基酸需求模式[4]。因此，研究小黑豆乳清蛋白和水解多肽的保健功能，不但對減少廢水排放和環境保護有實際意義，而且可以為小黑豆藥物和功能食品的開發提供依據。

化學性肝損傷是由攝入的化學毒物或藥物在體內代謝或轉化所導致的肝臟慢性或急性損傷，據國內多家醫院統計數據，每年因肝損傷住院的患者占急性肝炎患者的10%，且呈逐年上升趨勢[5]，因而天然提取物開發保肝食品和藥品已成為研究的熱點。本實驗以CCl4誘導的小鼠急性肝損傷模型為對象，研究探討SBWP和SBWPE對急性肝損傷的保護作用，為小黑豆乳清的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用7周齡的昆明種雄性小鼠(SPF級，體質量22～25g)，由山西醫科大學動物中心提供。

本研究所用SBWP由本實驗室用堿溶酸沉法提取[6]；經檢測，該蛋白的干燥物中粗蛋白含量為47.3%；SBWPE采用537酸性蛋白酶水解SBWP得到，其中分子質量在3000u左右的多肽占總肽的85%。

谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)和甘油三酯(TG)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

TGL-16G型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；TG16A-WS臺式高速離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；MR1822高速冷凍離心機 法國Jouan公司；Lecia RM2255輪轉式切片機 德國Leica儀器公司；體視顯微鏡 上海光學儀器廠；顯微電子攝像機 杭州科藝科技公司；Spectramax M5酶標儀 天津泰科嘉華金屬貿易有限公司；Olympus BX51顯微照相儀 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養與模型建立

實驗小鼠經適應性喂養后，隨機分為基礎組、模型組及SBWP高、低劑量組和SBWPE高、低劑量組6組。基礎組和模型組喂食基礎飼料，其配方為：面粉與麩皮各10%、玉米面34%、高粱面14.5%、豆餅粉20%、植物油1.5%、魚粉5%、骨粉2%、食鹽、干酵母、魚油乳液各1%，VB2加入量為60mg/kg飼料；SBWP與SBWPE高、低劑量組的飼料是在基礎飼料中分別按36g/kg飼料和12g/kg飼料的量加入相應受試物，每只動物的日投食量均為5g，若動物體質量以30g/只計算，則相當于日攝入SBWP與SBWPE 0.18g和0.06g，實驗期為30d。各組動物自由飲水，于實驗第30天，各組動物稱質量后禁食16h，模型組和各劑量組動物灌胃5mL/kg的1% CCl4溶液，基礎組灌胃等量的生理鹽水；24h后處死動物，測定各項生化指標并進行肝臟組織學與形態學觀察。

1.3.2 血清與肝臟中生化指標測定方法

實驗結束后，動物摘眼球取血，冷凍離心分離血清，按照試劑盒的要求測定血清AST和ALT的活力單位數；之后頸椎脫臼處死小鼠，解剖、稱取一定質量的肝臟，用4℃的生理鹽水洗去污血和雜物，加入肝臟質量10倍體積的生理鹽水，在冰浴中充分研磨成細漿，再以3000r/min離心取上清液，按照試劑盒的方法測定肝勻漿中MDA含量和TG含量；用Folin-酚法測定肝蛋白含量[7]；用5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(TDNB)法測定肝臟GSH含量[8]。

1.3.3 肝臟形態學和組織學觀察與分析

取新鮮肝臟，在體視顯微鏡下觀察形態變化，并用100倍電子攝像機攝像。取小鼠肝左葉相同部位組織，經10%福爾馬林固定、石蠟包埋及二甲苯透明后切片，經HE染色，光鏡下觀測肝細胞的結構。

1.4 統計分析

實驗數據使用SPSS18.0軟件處理，組間差異采用t檢驗。

2 結果與分析

2.1 實驗過程中各組動物的體質量變化

表 1 實驗動物的體質量變化及動態分析(±s，n=10)Table 1 Body weight change and dynamic analysis of experimental mice (±s，n=10)

表 1 實驗動物的體質量變化及動態分析(±s，n=10)Table 1 Body weight change and dynamic analysis of experimental mice (±s，n=10)

注： *.與基礎組比較，差異顯著(P ＜0.05)；**.與基礎組比較，差異極顯著(P ＜0.01)。

組別 體質量/g 0周2周4周基礎組24.69±1.6931.88±1.4835.20±1.10模型組24.27±1.9731.87±2.5835.02±2.32 SBWP高劑量組24.07±0.9722.71±2.51**32.19±2.39**SBWP低劑量組24.91±1.0125.48±1.78**33.21±2.11**SBWPE高劑量組25.3±1.6030.92±1.5234.19±2.79 SBWPE低劑量組24.68±1.1832.35±1.8535.64±2.24

由表1可見，實驗開始時各組動物體質量基本相同；實驗第2～4周，SBWP高、低劑量組小鼠與同期基礎組和模型組比，體質量偏低，且差異極顯著(P＜0.01)，SBWPE組無體質量減輕現象。可能是因為乳清蛋白中的胰蛋白酶抑制劑降低了動物對蛋白質的消化和吸收利用所導致[9]。

2.2 SBWP和SBWPE對血清ALT、AST活力的影響

表 2 SBWP與SBWPE對CCl4肝損傷小鼠血清ALT、AST活力單位數的影響(±s，n=10)Table 2 Effects of SBWP and SBWPE on ALT and AST activities in CCl4-induced liver injury in mice (±s，n=10)

表 2 SBWP與SBWPE對CCl4肝損傷小鼠血清ALT、AST活力單位數的影響(±s，n=10)Table 2 Effects of SBWP and SBWPE on ALT and AST activities in CCl4-induced liver injury in mice (±s，n=10)

注： *.與模型組比較，差異顯著(P ＜0.05）；**.與模型組比較，差異極顯著(P ＜0.01）。下同。

組別 劑量/(g/(kg·d))AST活力/(U/L)ALT活力/(U/L)基礎組051.83±6.41**45.06±5.88**模型組0100.19±9.05176.19±23.46 SBWP高劑量組696.47±8.51156.14±19.74**SBWP低劑量組298.02±10.73166.62±12.06*SBWPE高劑量組691.73±11.57*160.33±15.49*SBWPE低劑量組290.62±9.65*165.81±16.25*

由表2可知，與基礎組相比，模型組小鼠血清的AST、ALT活力極顯著升高(P＜0.01)，說明肝損傷建模成功。與模型組比較，SBWP和SBWPE的高、低劑量組均可以明顯降低ALT水平(P＜0.05或P＜0.01)；相對于AST來說，SBWPE的高、低劑量組均有顯著降低(P＜0.05)，而SBWP各組均無明顯降低。說明SBWP和SBWPE對CCl4型肝損傷模型小鼠ALT功能的保護有積極作用，但對于AST的降低作用尚不一致。

2.3 SBWP和SBWPE對小鼠肝臟TG、MDA、GSH含量的影響

表 3 SBWP與SBWPE對CCl4肝損傷小鼠肝臟TG、MDA和GSH含量的影響(±s，n=10)Table 3 Effects of SBWP and SBWPE on TG, MDA and GSH contents in CCl4-induced liver injury mouse liver (±s，n=10)

表 3 SBWP與SBWPE對CCl4肝損傷小鼠肝臟TG、MDA和GSH含量的影響(±s，n=10)Table 3 Effects of SBWP and SBWPE on TG, MDA and GSH contents in CCl4-induced liver injury mouse liver (±s，n=10)

組別 劑量/(g/(kg·d)) TG含量/(mmol/L) MDA含量/(nmol/mg pro) GSH含量/(μmol/g pro)基礎組02.05±0.31**3.02±0.20**6.29±0.80**模型組02.81±0.906.21±0.692.42±0.55 SBWP高劑量組61.30±0.52**4.78±0.44**3.61±0.27**SBWP低劑量組22.66±0.664.85±0.64**2.46±0.63 SBWPE高劑量組61.32±0.58**4.84±0.50**3.73±0.46**SBWPE低劑量組22.48±0.456.09±0.652.53±0.49

由表3可見，小鼠CCl4灌胃24h后，模型組肝TG、MDA的含量較基礎組明顯升高，GSH含量極顯著降低(P＜0.01)，說明急性肝損傷建模成功。SBWP和SBWPE高劑量組的TG、MDA和GSH含量與模型組相比均有極顯著的改善(P＜0.01)，而在低劑量SBWP和SBWPE實驗組中，除SBWP有降低MDA效果外(P＜0.01)，其他各項指標與模型組相比均無明顯變化。提示飼料中加入量為36g/kg的小黑豆乳清蛋白和水解多肽能顯著抑制TG和MDA產物的生成，提高抗氧化物質GSH的含量；而12g/kg的加入量對降低肝臟TG和提高GSH作用不明顯。

2.4 SBWP和SBWPE對小鼠肝臟形態學的影響

2.4.1 肝臟形態學觀察

圖 1 CCl4肝損傷小鼠肝臟形態學比較 (×100)Fig.1 Morphology of hepatic injury in CCl4-induced mice administered with SBWP and SBWPE at various dosages(×100)

顯微(圖1)觀察可以看到，基礎組肝臟呈暗紅色，肝細胞表面光滑，質地柔軟，無脂肪滴。模型組肝臟表面呈粗糙的沙粒狀，顏色泛白無光澤且有變性脂肪滴溢出，組織很脆且很易出血、邊緣外翻[10]。SBWP高劑量組和SBWPE高劑量組的肝臟與基礎組動物肝臟很相近，表面呈暗紅色；SBWP低劑量組和SBWPE低劑量組的小鼠肝臟顏色也比較暗淡、呈細小顆粒狀和輕微的變性脂肪滴，與模型組的肝臟形態相近，但較模型組有改善。可以看出SBWP和SBWPE對由CCl4引起的急性肝損傷有明顯的改善作用，且呈一定的量效關系。

2.4.2 肝組織學分析

圖 2 小鼠肝組織形態學變化 (×400)Fig.2 Histological changes of liver in mice (×400)

肝組織切片(圖2)可見，基礎組小鼠的肝細胞大小均勻、整齊，肝小葉輪廓清晰，細胞分界清，細胞核圓而清晰，胞質豐富，未見細胞變性和異常。模型組肝細胞嚴重損傷，正常組織結構明顯消失，小葉界限不清，細胞索紊亂，大部分肝竇消失，肝細胞廣泛性水樣變性，核膜皺縮，有破碎的核，可見點狀壞死甚至崩裂[11-12]，可見急性肝損傷建模成功。SBWP和SBWPE高、低劑量組的肝細胞壞死、氣球樣變、水樣變性和胞漿凝聚等病變情況都較模型組有不同程度減輕，其中以SBWP高劑量組的情況為最好，接近于基礎組。可見，SBWP和SBWPE這兩種物質及劑量的不同對CCl4急性肝損傷的保護效果有所不同：SBWP對修復肝臟組織結構效果比較明顯，SBWPE對于保護肝細胞膜以及亞細胞器的結構完整效果更明顯，且均是高劑量組的肝細胞比低劑量組的更接近正常。

3 討 論

用CCl4誘導的急性肝損傷是肝損傷的一種常用模型，用來檢測或研究藥物或其他物質對肝損傷的保護作用。CCl4進入體內活化生成三氯甲基自由基和過氧自由基,攻擊肝臟細胞膜上的磷脂分子，使得細胞膜、內質網膜發生氯烷化和脂質過氧化，因而造成TG含量升高、GSH含量降低、MDA含量升高和代謝紊亂；CCl4代謝產物還會破壞肝細胞膜結構和功能的完整性，致使ALT、AST滲漏入血、活力升高。而有保肝作用的活性物質可以通過抗氧化和清除自由基，使CCl4肝損傷模型動物的生化指標和病變肝臟得到糾正[13-14]。從抗氧化指標看，無論SBWP還是SBWPE，均為6g/(kg·d)劑量組優于2g/(kg·d)劑量組，說明兩者的抗氧化效果在此劑量范圍內存在效量關系；肝組織學和形態學檢測也說明，SBWP和SBWPE高劑量組對CCl4型小鼠急性肝損傷的保護作用優于低劑量組，其恢復效果與抗氧化效果基本一致。由此可見，小黑豆乳清蛋白和水解多肽可能是通過抗脂質過氧化作用來促進肝細胞的再生和修復，并體現其保肝作用的[15]。本研究發現，SBWP和SBWPE對降低ALT效果顯著，而SBWP對AST的效果不明顯，原因可能是ALT主要分布在肝細胞漿，而AST主要分布在肝細胞的線粒體中，SBWP修復受損肝細胞線粒體的作用不如在細胞漿中明顯，使受損線粒體中大量AST溶出[16]，其機制還有待進一步研究。

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